王淑顏，汪溪潔，胡曉敏，馬 璟

(1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203;2.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京 100038)

新藥開(kāi)發(fā)是一個(gè)漫長(zhǎng)而艱巨的過(guò)程。評(píng)價(jià)新藥的安全性和有效性是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，新藥的安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)主要是基于動(dòng)物或體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞。然而由于種屬差異，這些評(píng)價(jià)體系不能充分反映臨床用藥后的安全性如13－順式維甲酸［1－2］和沙利度胺［3－5］的代謝動(dòng)力學(xué)在動(dòng)物體內(nèi)與人體內(nèi)有著很大的差別。因此，動(dòng)物模型無(wú)法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)人源性毒性，使得使用動(dòng)物模型評(píng)價(jià)藥物的靶器官毒性是導(dǎo)致藥物研發(fā)效率低的主要問(wèn)題。近年來(lái)，具有自我復(fù)制和分化能力的人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，是解決以上問(wèn)題的一種方法。

1 人胚胎干細(xì)胞

ESC來(lái)源于著床前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是一類(lèi)未分化的二倍體全能干細(xì)胞。在離體情況下具有自我增殖的能力，同時(shí)可分化為各種祖細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)因子的作用下，后者可進(jìn)一步分化為許多具有特定功能的細(xì)胞系。1998年，Thomoson等［6］首次成功獲得hESC，標(biāo)志著生物醫(yī)學(xué)一個(gè)新的研究領(lǐng)域的誕生，這些細(xì)胞被從稱(chēng)之為胚泡(受精卵成長(zhǎng)到4～5 d時(shí))的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái)。迄今為止，已獲得400多個(gè)hESC細(xì)胞株。提出hESC的最初目的是針對(duì)它替代治療的潛在作用，但目前的研究熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到開(kāi)發(fā)體外藥物篩選和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)模型方面。排名前20的制藥公司中，70%的公司已啟動(dòng)了涉及干細(xì)胞的研究，其中64%涉及到hESC的研究［7］。

2 人胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)

hESC與其他細(xì)胞相比明顯不同，具有以下生物學(xué)特點(diǎn):①具有自我復(fù)制、無(wú)限增殖不分化的能力;②具有分化的多能性，在體外適宜條件下，可分化為3個(gè)胚層的所有細(xì)胞;③ 具有穩(wěn)定的遺傳功能，在分化過(guò)程中能保持原有生理特性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn);④具有生殖細(xì)胞的特性，能產(chǎn)生精子或卵子細(xì)胞;⑤保持正常的二倍體特性且核型正常;⑥ 具有全能性，在解除分化抑制的條件下，具有分化為機(jī)體的任一細(xì)胞類(lèi)型和形成多種組織器官的能力;⑦可操作性，即易于進(jìn)行基因改造［8－10］。

3 人胚胎干細(xì)胞的定向分化

3.1 人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞

hESC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法有3種，擬胚體形成法、與內(nèi)胚層細(xì)胞共培養(yǎng)法及加入特定誘導(dǎo)因子定向分化法。hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞屬于幼稚型心肌細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)形態(tài)上一般經(jīng)過(guò)3個(gè)階段:早期階段，呈圓形肌原纖維，稀疏且隨機(jī)分布，顯示A和I帶;中期階段，肌小結(jié)結(jié)構(gòu)逐漸完善，心肌細(xì)胞收縮更有組織性;晚期階段，分化為心房、心室和起搏傳導(dǎo)等終末細(xì)胞［11］;在分子表達(dá)水平上，表達(dá)人心臟特異性基因，如α輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白Ⅰ、心臟α－主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)、β－MHC 和心房利納因子等;在電生理方面，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞表達(dá)If，Na+，L型－Ca2+和 K+等離子通道及人特異性動(dòng)作電位形態(tài)［12］。這些特性可通過(guò)光鏡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、免疫細(xì)胞化學(xué)和透射電子顯微鏡等方法進(jìn)行檢測(cè)。由此可見(jiàn)，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)功能上與自然心肌細(xì)胞具有相似性，且為人源性具有無(wú)限增殖和可再生的能力。因此，采用hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞預(yù)測(cè)藥物心臟毒性，可有效避免種屬差異，且實(shí)驗(yàn)周期短，化合物用量少，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 由人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞

hESC誘導(dǎo)分化后3周形成均一的、純度＞90%的肝樣細(xì)胞，具有肝細(xì)胞典型的形態(tài)結(jié)構(gòu):六邊形的細(xì)胞形態(tài)，大而較暗的細(xì)胞質(zhì)和明亮含有核仁的細(xì)胞核;通過(guò)高碘酸染色檢測(cè)到具有合成和儲(chǔ)存糖原的能力;通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和qRT－PCR檢測(cè)到hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性基因白蛋白、亞砷酸鹽相關(guān)基因1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1、肝細(xì)胞核因子4a、凝血因子Ⅶ和肝細(xì)胞特異性蛋白，如胞內(nèi)酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、細(xì)胞表面蛋白去唾液酸糖蛋白受體1和分泌白蛋白;同樣運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)和qRT－PCR法檢測(cè)到hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞表達(dá)具有活性的細(xì)胞色素 P450 1A(cytochrosome P450 1A，CYP1A)，CYP2B6，CYP2C9和 CYP3A等 CYP家族酶;利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白探針?biāo)幬锒康貦z測(cè)到hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞表達(dá)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1、鈉離子－?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白及消除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BSEP［13－14］。藥物代謝酶CYP家族和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物的代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞表達(dá)幾個(gè)重要的藥物CYP代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且這種細(xì)胞資源為人源性的，不存在種屬差異，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，減少動(dòng)物使用量，符合“減少、替代、優(yōu)化”原則，有應(yīng)用于藥物研發(fā)過(guò)程中毒性研究的潛力。

4 人胚胎干細(xì)胞在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

4.1 人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞在心臟毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

心臟毒性是藥物研發(fā)失敗的主要原因之一，也是新藥研發(fā)和安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵因素。因此，在藥物研發(fā)過(guò)程中，所有新化合物必須進(jìn)行臨床前心臟毒性檢測(cè)，評(píng)價(jià)潛在威脅生命事件或誘導(dǎo)性心臟病的發(fā)病率。藥物心臟毒性的臨床表現(xiàn)主要包括藥物誘導(dǎo)性心律失常、心肌炎、心肌病、心肌缺血性毒性、心肌梗死和瓣膜性毒性等［15］。近年來(lái)，很多藥物因不可預(yù)見(jiàn)的心臟毒性而被撤市，這是藥物研發(fā)后期失敗的主要原因。因此，在藥物研發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)藥物致命性的副作用，可大大減小新藥開(kāi)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是，許多非心血管藥物由于心臟毒性而被撤市，且這些心臟毒性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)，如西沙必利、氟哌利多和羅非昔布等。某跨國(guó)制藥公司調(diào)查結(jié)果顯示，人類(lèi)心臟毒性與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟毒性的一致性只有20%［16］，這個(gè)事實(shí)強(qiáng)烈支持使用基于人體組織的毒性評(píng)價(jià)。

2012年安全性藥理學(xué)會(huì)年會(huì)上有關(guān)ESC應(yīng)用的論文數(shù)目迅速增加，由每年1篇(2005－2007)到2012年27篇［17］，表明hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用越來(lái)越引人注目。hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞具有很多潛在的優(yōu)勢(shì)。Jonsson等［18］通過(guò)膜片鉗技術(shù)評(píng)價(jià)hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的電生理特性和預(yù)測(cè)潛在藥物性心率失常的能力，強(qiáng)調(diào)hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞適用于當(dāng)代藥物的篩選模型。主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:① 搏動(dòng)頻率 ＜50 min－1、動(dòng)作電位間期(action potentials duration，APD)＞200 ms的hESC誘導(dǎo)分化的心室肌細(xì)胞束具有更加成熟的心室樣表型，這點(diǎn)也得到了基因表達(dá)分析的支持。②給予快速延遲整流性鉀通道基因通道抑制劑 E－4031 1 μmol·L－1后，APD＞300 ms的心室肌樣細(xì)胞束觀察到早后除極的發(fā)生，而APD＜300 ms的心室肌樣細(xì)胞束則未觀察到。③ 由hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞模型獲得的數(shù)據(jù)在定量和定性?xún)煞矫婢芎屯闷挚弦袄w維束模型相媲美。受試者工作特征曲線表明，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞模型至少可以相當(dāng)于兔浦肯野纖維束模型有效地預(yù)測(cè)心律失常事件。同樣地，Peng等［19］用hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞和犬的浦肯野纖維束進(jìn)行了藥理學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞對(duì)引起動(dòng)作電位改變的多離子通道阻滯劑藥物具有高敏感性，如特異H1受體阻斷劑特非那定(terfenadine)、Na+通道抑制劑奎尼丁和Ca2+阻滯劑維拉帕米等。hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的高敏感性在于種屬差異在離子通道表達(dá)上的不同。另外，和浦肯野纖維束相比，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞更明顯的優(yōu)勢(shì)是穩(wěn)定性更高、實(shí)驗(yàn)周期更短和藥物作用效果更直接。

hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞可與多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，用于藥物心臟毒性的安全性評(píng)價(jià)，如倒置顯微鏡、膜片鉗和微電極陣列等，通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞暴露受試物后收縮頻率、動(dòng)作電位時(shí)程、節(jié)律、興奮性、復(fù)極化和傳導(dǎo)性的變化評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性。2013 年，Himmel［20］利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)藥物E4031、多非利特、噴他脒和維拉帕米(異搏定)對(duì)干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞收縮性的作用，通過(guò)分析心肌細(xì)胞的收縮幅度、搏動(dòng)頻率和節(jié)律的變化評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性。該實(shí)驗(yàn)表明，將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞接種到實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)底部帶有電極的96孔板上，當(dāng)心肌細(xì)胞收縮舒張時(shí)引起阻抗變化，將這種阻抗變化換算成細(xì)胞指數(shù)分析心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、節(jié)律、幅度和搏動(dòng)間期的變化對(duì)藥物的心臟毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。這種方法可在近似生理環(huán)境下，評(píng)價(jià)離子通道和非離子通道藥物以及多種藥物對(duì)心肌細(xì)胞的相互作用，具有高通量、實(shí)驗(yàn)成本低、工作量小和化合物用量少等優(yōu)點(diǎn)。由此可見(jiàn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越大。

近年來(lái)，在基于hESC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的毒理學(xué)研究中，心臟毒性標(biāo)志物越來(lái)越受到重視。例如，培養(yǎng)基中心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart type fatty acid binding protein，HFABP)的釋放量可用來(lái)衡量心肌細(xì)胞損傷。cTnT是評(píng)價(jià)藥源性心臟毒性和心肌損害的重要生物標(biāo)志物，cTnT在心肌損傷時(shí)從心肌纖維上降解釋放入血，引起血清cTnT增高。因此，測(cè)定血清cTnT濃度即可反映心肌細(xì)胞的損傷情況，在臨床，cTnT被稱(chēng)為心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。HFABP是一種在心肌細(xì)胞質(zhì)中含量豐富、穩(wěn)定的小分子量蛋白，這種小分子量水溶性蛋白能通過(guò)快速擴(kuò)散進(jìn)入血液，心肌損傷后90 min即可檢測(cè)到，6 h釋放量達(dá)到峰值，36 h回歸正常水平，可能是藥源性心臟毒性評(píng)價(jià)中一個(gè)更加敏感的生物標(biāo)志物［21］。通過(guò)測(cè)定藥物暴露后hESC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的cTnT和HFABP的釋放量評(píng)價(jià)藥物的心臟毒性是一種新穎的方法。hESC誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞為人源性的，比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更具有臨床相關(guān)性，cTnT在臨床上是心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，HFABP可能具有更高的靈敏性。因此，hESC誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞更適合藥物心臟毒性的體外實(shí)驗(yàn)。

4.2 人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞在肝毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

藥物性肝損傷(drug－induced liver injury，DILI)是臨床常規(guī)治療中出現(xiàn)的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是藥物頻繁撤市的主要原因。在近期的一次DILI調(diào)查中，已批準(zhǔn)的298種藥品被確定具有導(dǎo)致肝損傷的副作用。其中265種藥物與急性肝衰竭有關(guān)，6種無(wú)論是在美國(guó)還是歐洲都已被暫停銷(xiāo)售或撤市［22］。另外，一些中草藥也具有廣泛的肝毒性，如雷公藤［23］。藥物及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)肝毒性的機(jī)制主要包括抑制線粒體功能［24－25］、破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、激活細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、抑制特定的酶或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其是膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及活性代謝產(chǎn)物的形成，可能會(huì)導(dǎo)致直接的毒性或免疫原性。雖然有些DILI在臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以被檢測(cè)到，但大部分DILI在人身上很少發(fā)生，部分肝毒性只有在上市后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的使用后被發(fā)現(xiàn)，且沒(méi)有明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。因此，急需建立模擬人肝細(xì)胞的體外毒性實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，即建立基于hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的毒性篩選模型。

Hengstler等［26］提出，hESC 誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞在具有以下功能特性后才能定義為真正的肝細(xì)胞，這些功能特性主要表現(xiàn)為代謝外源化合物和內(nèi)源性物質(zhì):合成和分泌白蛋白、凝血因子、補(bǔ)體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膽汁、脂類(lèi)和脂蛋白;儲(chǔ)存葡萄糖(糖原)、脂溶性維生素A、維生素D、維生素E和維生素K，葉酸，維生素B12、銅和鐵。近年來(lái)，分析hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞特征主要包括形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)特征、基因表達(dá)和功能特征［27］。形態(tài)學(xué)分析顯示，hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的細(xì)胞核為多邊形和不同的圓形，以及肝細(xì)胞特定的超微結(jié)構(gòu)特征，如核仁顯著、發(fā)達(dá)的高爾基體、豐富的線粒體和溶酶體，糖原顆粒、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、膽汁淤積等［28－33］。在肝中，藥物主要由Ⅰ相和Ⅱ相酶代謝。大量研究表明，DILI主要是由CYP3A酶家族產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物造成的。因此，hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞應(yīng)用于藥物早期篩選關(guān)鍵是CYP3A家族酶活性，且在體內(nèi)藥物主要是由 CYP3A4代謝，但是沒(méi)有研究表明hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞與原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的CYP酶活性相似。Ulvestad等［14］研究表明，hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后CYP3A酶的活性與原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的CYP3A酶活性相似。更重要的是，hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的CYP3A酶活性穩(wěn)定時(shí)間至少＞1周，而原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的CYP3A酶活性在48 h后開(kāi)始下降，可見(jiàn)hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞允許給藥＞1周，且具有藥物主要體內(nèi)代謝酶，因此，hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞具有支持長(zhǎng)期體外毒性實(shí)驗(yàn)的潛力。hESC的自我增殖和復(fù)制能力為實(shí)驗(yàn)研究提供了取之不遏的資源，它是人源性且可來(lái)源于患者，構(gòu)建疾病模型，有效避免了種屬差異，以及健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下的差異，具有更高的臨床相關(guān)性;減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量，符合“減少、替代、優(yōu)化”原則。

目前，hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的新陳代謝能力、外源化合物Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達(dá)以及等離子體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平均和肝、體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞近似［34］。因此，hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞模型可在藥物研發(fā)早期識(shí)別引起肝損傷的化合物，但目前僅極少數(shù)研究機(jī)構(gòu)有能力生產(chǎn)足夠多的、有質(zhì)量保證的肝細(xì)胞進(jìn)行大型的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯?。所以，hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞在毒理學(xué)評(píng)價(jià)中仍處于起步階段。歐洲委員會(huì)和歐洲聯(lián)盟制藥企業(yè)提出的“創(chuàng)新藥物引起的肝損傷”的倡議，在未來(lái)幾年內(nèi)，將有可能促進(jìn)hESC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞在新藥研發(fā)中的運(yùn)用。然而，下一階段的驗(yàn)證研究則是一個(gè)大型跨學(xué)科項(xiàng)目，涉及到hESC誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的生產(chǎn)商、毒理學(xué)家、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家以及制藥公司和監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

5 展望

近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到hECS在藥物研發(fā)和毒理學(xué)中廣闊的應(yīng)用前景。hECS的無(wú)限增殖、同源性、可分化為任一細(xì)胞的特性，為藥物的安全性評(píng)價(jià)提供了豐富的資源，克服了由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推向人的種屬差異性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)周期短、用藥量少，大大減少了藥物安全評(píng)價(jià)中的人力物力，降低了藥物研發(fā)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)成本。但同時(shí)，仍有許多問(wèn)題需要解決。例如提出高效、定向分化為特異性細(xì)胞類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)方案，細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增平臺(tái)，提高h(yuǎn)ECS向心肌細(xì)胞分化的純度和效率，建立一項(xiàng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的hECS向肝細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)方案等。綜上所述，雖然hECS技術(shù)仍存在許多瓶頸，但它巨大的應(yīng)用前景必將推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。

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