洪 冰 李云鵬 武凱歌 馬文校 錢益嘯 羅 丹 文小敏

三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能影響的研究

洪 冰1李云鵬2武凱歌2馬文校2錢益嘯2羅 丹2文小敏2

目的探討三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能相關(guān)指標(biāo)的影響作用。方法將50只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、三仁湯（高、中、低劑量）組，利用復(fù)合因素復(fù)制脾胃濕熱證動(dòng)物模型。通過稱量法計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)，同時(shí)采用放射免疫法檢測(cè)大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、血清皮質(zhì)醇（Cor）、白介素2（IL-2）的水平。結(jié)果造模成功后的各組大鼠血漿CRH、ACTH及血清Cor升高，三仁湯治療組各劑量對(duì)其均有降低作用。造模后各模型組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IL-2降低，三仁湯（高、中、低劑量）組可以升高模型組大鼠上述指標(biāo)的水平（P <0.05）；且以上兩種結(jié)果均以中劑量組效果最好。結(jié)論復(fù)合因素造?？梢允蛊⑽笣駸嶙C大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能發(fā)生異常改變，三仁湯可以調(diào)節(jié)脾胃濕熱證大鼠上述功能，這可能是清熱祛濕的機(jī)理之一。

三仁湯；脾胃濕熱證；神經(jīng)內(nèi)分泌免疫

脾胃濕熱證是因感受濕熱之邪，過食辛熱肥甘，久之釀成濕熱，內(nèi)蘊(yùn)脾胃而形成，嶺南地區(qū)常見多發(fā)。該證臨床癥狀復(fù)雜，病程較久，病勢(shì)纏綿難愈，在脾胃濕熱證的發(fā)生發(fā)展過程中，各種致病因素的刺激會(huì)使軀體做出應(yīng)激反應(yīng)，而導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能（Neuroendocrine Immune Functions,NEI）發(fā)生反應(yīng)。三仁湯出自吳鞠通《溫病條辨》，能宣上、暢中、滲下，具清利濕熱、宣暢三焦氣機(jī)之功，是用來治療濕熱初起的經(jīng)典方[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過復(fù)合因素（外部濕熱環(huán)境、肥甘飲食及微生物）造成脾胃濕熱證大鼠模型，并探討三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠NEI相關(guān)指標(biāo)的影響。

材料和方法

一、材料

1.三仁湯藥物組成

參照《溫病條辨》原組成比例，苦杏仁、法半夏各15 g，飛滑石、生薏苡仁各18 g，白通草、白蔻仁、淡竹葉、川厚樸各6 g。以上藥物購(gòu)自南方醫(yī)院中藥房。各藥物在水中浸泡30 min，加水量約為藥量8倍，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中揮發(fā)的藥物成分，將3次藥汁混合，離心取澄清藥汁，依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》中人與大鼠劑量換算公式（大鼠按每只200 g體質(zhì)量計(jì)算）[2]，濃縮配制成0.41、0.82、1.64 g/mL濃度藥液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.高糖高脂飼料

普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜加工而成，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)（SCXK（粵）2006-0015），體質(zhì)量（200±20）g，隨機(jī)分為5組，每組10只。

4.菌種及試劑

侵襲性大腸桿菌，濃度為109/mL，由南方醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。CRH、ACTH、Cor、IL-2放免試劑盒均購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。

5.實(shí)驗(yàn)儀器

AvantiTM230型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；PL303型電子天平（梅特勒托利多儀器<上海>有限公司）；SN-695型放射免疫r計(jì)數(shù)測(cè)量系統(tǒng)（上海核輔光電儀器有限公司）；南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生熱帶學(xué)院仿真模擬氣候倉(cāng)（可以調(diào)節(jié)溫度、濕度、風(fēng)速等）。

二、方法

1.動(dòng)物分組

將50只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成5組，分別為正常對(duì)照組、脾胃濕熱證組、三仁湯（低劑量、中劑量、高劑量）組，每組10只。造模組動(dòng)物均于造模前禁食12 h，自由飲水。

2.造模方法

①正常對(duì)照組：在溫度20～28℃，相對(duì)濕度50%～60%的環(huán)境下，以普通混合飼料喂養(yǎng)。②脾胃濕熱證大鼠模型：肥甘飲食飼料（在普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜）喂養(yǎng)10 d。然后置于仿真模擬氣候倉(cāng)[環(huán)境設(shè)置為：溫度（33±2）℃，相對(duì)濕度（75± 5）%，每天上午9時(shí)至11時(shí)]共8 d。第19天上午9時(shí)開始灌胃，按2 mL/200 g給予大腸桿菌1次，24 h后再加強(qiáng)感染1次（1 mL/200 g），移出置于自然環(huán)境，7 d后動(dòng)物處死做相關(guān)檢查。③三仁湯低劑量組（0.41 g/mL）：在脾胃濕熱證大鼠模型的基礎(chǔ)上，移出置于自然環(huán)境12 h后開始灌服三仁湯煎劑，2 mL/200 g，日1次，7 d后動(dòng)物處死做相關(guān)檢查。④三仁湯中劑量組（0.82 g/mL）：脾胃濕熱證大鼠模型的基礎(chǔ)上，移出置于自然環(huán)境12 h后開始灌服三仁湯煎劑，2 mL/200 g，日1次，7 d后動(dòng)物處死做相關(guān)檢查。⑤三仁湯高劑量組（1.64 g/mL）：脾胃濕熱證大鼠模型的基礎(chǔ)上，移出置于自然環(huán)境12 h后開始灌服三仁湯煎劑，2 mL/200 g，日1次，7 d后動(dòng)物處死做相關(guān)檢查。

3.標(biāo)本采集及檢測(cè)

大鼠處死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.7 mL/200 mg腹腔注射麻醉，迅速打開腹腔，①檢測(cè)血漿CRH、ACTH：經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL注入加有EDTA和抑肽酶的采血管內(nèi)，輕緩混勻，4℃3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-20℃冰箱凍存待測(cè)；②檢測(cè)血清Cor、IL-2：經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL注入普通采血管待凝固后，4℃3 000 rpm離心10 min，分離血清，-20℃冰箱凍存待測(cè)。③胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：大鼠處死后，置于放有冰塊的搪瓷盤中迅速剖開胸腔和腹腔，拭干，分別取胸腺、脾臟稱重，分別計(jì)算與體質(zhì)量之比，為胸腺和脾臟指數(shù)（mg/g）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、癥狀和體征

造模前，所有大鼠表現(xiàn)正常，動(dòng)作靈活，皮毛潔白光澤，攝食飲水正常，大便成形，體溫正常。造模后，正常組無明顯改變。模型組大鼠則隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱，倦怠，嗜臥懶動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)蓬松，顏色枯槁；納呆，不欲飲水，排便次數(shù)增多，從造模第10天開始，均出現(xiàn)大便溏泄或粘膩，體溫升高較快，進(jìn)入仿真氣候倉(cāng)后，大便溏泄或粘膩癥狀加重，漸見肛周污穢。三仁湯高、中、低劑量組灌服三仁湯后，活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，飲水、飲食量增加，大便漸漸恢復(fù)正常，體溫恢復(fù)到正常水平。

二、各組大鼠血漿CRH、ACTH、血清COR含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、血清COR含量明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，三仁湯（高、中、低劑量）組大鼠血漿CRH、ACTH、血清Cor含量顯著降低，有顯著性差異（P< 0.01），尤以三仁湯中劑量組效果最好，其中對(duì)降低CRH，中劑量效果優(yōu)于高低劑量，而降低ACTH，中劑量?jī)?yōu)于低劑量，但與高劑量無明顯差別。而降低Cor，則中劑量?jī)?yōu)于高劑量，與低劑量無明顯差別，見表1。

表1 各組大鼠血漿CRH、ACTH，血清Cor含量比較（x±s，pg/mL）

三、各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)、血清IL-2含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)及血清IL-2明顯降低，有顯著性差異（P<0.05）。三仁湯（高、中、低劑量）對(duì)降低的胸腺、脾臟指數(shù)、血清IL-2均有升高作用，但只有中劑量改善效果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體見表2。

表2 各組大鼠胸腺、脾臟指數(shù)、血清IL-2含量比較（x±s）

討論

脾胃濕熱證是臨床常見和多發(fā)病證，《濕熱病篇》指出：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱?！惫省皟?nèi)外合邪”是濕熱病證的發(fā)病特點(diǎn)。本課題組在國(guó)內(nèi)脾胃濕熱證動(dòng)物模型的研究基礎(chǔ)上，根據(jù)脾胃濕熱證的發(fā)病特點(diǎn)，參考既往文獻(xiàn)報(bào)道的造模方法[3-5]，以高糖高脂造成濕熱內(nèi)環(huán)境，以高溫高濕模擬濕熱外環(huán)境，結(jié)合生物致病因子（大腸桿菌作為致病外邪），以“內(nèi)濕熱+外濕熱+生物致病因子”的復(fù)合造模方法模擬“內(nèi)外合邪”，通過癥狀體征的觀察及“經(jīng)方反證”，成功復(fù)制脾胃濕熱證大鼠模型。

在應(yīng)激條件下，機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（HPA）會(huì)被激活，下丘腦接受來自高位中樞信息時(shí)，便合成和釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），然后作用于垂體使其分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），ACTH使腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素（Cor），從而引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂[6-7]。有研究通過濕熱環(huán)境加上小劑量致瀉劑建立兔腸易激綜合征（IBS）模型，發(fā)現(xiàn)ACTH等神經(jīng)內(nèi)分泌激素及其相關(guān)電解質(zhì)有變化，表明神經(jīng)體液內(nèi)分泌系統(tǒng)參與了兔IBS的發(fā)生過程[8]。本研究通過外部濕熱環(huán)境、病原微生物感染和肥甘飲食等復(fù)合因素造模，在各種致病因素的刺激下，結(jié)果顯示造模后各模型組的癥狀體征與脾胃濕熱證的臨床常見的癥候類似；經(jīng)過經(jīng)典方劑三仁湯治療后，造模動(dòng)物癥候逐步恢復(fù)正常，也反證了模型所模擬的癥候類似于脾胃濕熱證臨床所見的癥候群，表明脾胃濕熱證大鼠模型造模成功。并且從檢測(cè)指標(biāo)觀察，血漿CRH、ACTH、血清Cor與對(duì)照組均有明顯差別，顯著升高，而經(jīng)灌服三仁湯煎劑后，治療組相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)水平均降低，尤以中劑量組效果最好。表明三仁湯可以降低升高的CRH、ACTH、Cor，調(diào)節(jié)脾胃濕熱證大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌功能。

神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)間存在雙向往返的反饋聯(lián)系，神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂常影響免疫系統(tǒng)的改變[9]，胸腺和脾臟均為免疫器官，是淋巴細(xì)胞分化、成熟和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是衡量集體免疫功能的重要指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，胸腺和脾臟常會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量變輕，功能下降[10-11]。IL-2是一種細(xì)胞因子，主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。其水平高低是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要標(biāo)志之一，它可以促進(jìn)個(gè)體細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞和T細(xì)胞活性，是免疫增強(qiáng)因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組比較，模型組胸腺和脾臟指數(shù)、IL-2明顯降低，經(jīng)三仁湯灌服干預(yù)后，三仁湯各治療組均有升高，以中劑量組明顯，這可能是由于復(fù)合造模因素下導(dǎo)致大鼠免疫功能受抑制所致。

本研究選擇CRH、ACTH、Cor作為神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)，IL-2、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)作為免疫指標(biāo)，通過研究發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱證大鼠的上述神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫指標(biāo)均有相應(yīng)改變，提示脾胃濕熱證的發(fā)生與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)有關(guān)。通過三仁湯對(duì)脾胃濕熱證干預(yù)，可以改善其上述指標(biāo)，這可能是三仁湯清熱祛濕作用的機(jī)理之一。

1李云鵬,文小敏,武凱歌,等.三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠行為學(xué)及下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(1): 126-128.

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4呂冠華,勞紹賢.脾胃濕熱證動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià).廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,22(3):231-235.

5呂文亮,程方平,黃廷榮,等.燥濕運(yùn)脾湯對(duì)脾胃濕熱中阻證作用的實(shí)驗(yàn)研究.湖北中醫(yī)雜志,2002,24(4):8-9.

6武春霞.運(yùn)動(dòng)和慢性應(yīng)激對(duì)大鼠行為、免疫功能和神經(jīng)內(nèi)分泌的影響.太原:山西醫(yī)科大學(xué),2010:23.

7張曼,張麗萍,劉海鵬.應(yīng)激的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)研究進(jìn)展.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2008,24(2):215-217.

8趙泓舒,蔡月琴,潘永明,等.腸易激綜合征模型WHBE兔神經(jīng)-體液-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)的變化.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(2): 26-31.

9李煒,劉培,段金廒,等.香附四物湯對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控與影響.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20 (2):99-104.

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Effects of Sanren Decoction on neuroendocrine-immune functions of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats

HONG Bing1,LI Yun-peng2,WU Kai-ge2,MA Wen-xiao2,QIAN Yi-xiao2,LUO Dan2,WEN Xiao-min2.1）Hospital of Chinese Traditional and Western Medicine of Southern Medical University, Guangdong,Guangzhou 510315,China;2)School of TCM of Southern Medical University,Guangdong, Guangzhou 510515,China

Objective To study the effects of Sanren Decoction on neuroendocrine-immune function of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats.Methods Fifty male wistar rats were randomly divided into five groups:normal control group,model group,sanren decoction（low and medium and high dosage）groups.Thymus index and spleen index were calculated by quantified method.The levels of interleukin 2(IL-2),cortisol(Cort)in serum and adrenocorticotropic hormone(ACTH),corticotrophin releasing hormone (CRH)in plasma in different groups were detected by RIA.Results Compared with normal control group,the concentration of Cort in serum and ACTH,β-EP in plasma of the rats in the model group was significantly increased.The sanren decoction groups could reduce the levels of Cort in serum and ACTH,β-EP in plasma in different dosages(P<0.01 or P<0.05),especially the medium dosage had best outcome.Thymus index and spleen index and the concentration of IL-2 in serum of the rats in the model group was significantly decreased. Conclusion To establish the model of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats by complex factors can change neuroendocrine-immune functions.Sanren decotion can effctively adjust the functions of rats′neuroendcrine-immune,which may be one of the mechanism of clearing heat and expelling damp of Sanren Decotion.

Sanren Decoction;spleen and stomach damp-heat syndrome;NEI

2014-05-10）

（本文編輯：肖冰）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.03.003

1 510315南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；2 510515南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

文小敏，Email：wxm@fimmu.com

廣東省中醫(yī)藥局科研基金（2008195）；廣東省中醫(yī)藥管理局課題（20131242）；南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院長(zhǎng)基金（2201301002）