周俊佟，雷 雪,王雪梅,劉 佳,付殿斌,李麗靜

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

參附湯是療效確切的中醫(yī)名方，出自于明代醫(yī)家薛己《正體類要》，為溫里劑中回陽(yáng)救逆的代表方劑，由炮附子、人參組成，具有益氣回陽(yáng)固脫功效，用于陽(yáng)氣暴脫證，癥見四肢厥逆、冷汗淋漓、呼吸微弱、脈微欲絕等?，F(xiàn)已開發(fā)研究出參附注射液廣泛應(yīng)用于臨床。本文通過對(duì)比參附湯有效活性成分的萃取液和參附湯水煎液對(duì)急性心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響的區(qū)別，來推斷參附湯在體內(nèi)發(fā)揮作用的主要成分。通過采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌凋亡與自噬，推斷參附湯對(duì)心臟組織的作用機(jī)理。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK(吉)-2011-0004)。

1.2 藥品及儀器

參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664，10 ml×5)。異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，2 ml∶1 mg)、參附湯水煎萃取液、MP-150 16道生理記錄儀(美國(guó)Biopac公司)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene產(chǎn)品)。Beclin-1引物序列，β-actin，Caspase-3引物，SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒，為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 參附湯入血有效成分對(duì)急性心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、參附湯給藥組、參附湯萃取液給藥組各10只。空白對(duì)照組腹腔注射4 ml/kg生理鹽水，陽(yáng)性組腹腔注射6 ml/kg的參附注射液，參附湯給藥組灌胃給予2 ml/100 g參附湯水煎液，參附湯萃取液給藥組灌胃給予2 ml/100 g參附湯萃取液；除空白組外，其他各組均腹腔注射4 ml/kg的異丙腎上腺素，連續(xù)給藥5 d。第5天給藥后，參照孫成文[1]心衰模型制備方法,用1.2 g/kg烏拉坦腹腔注射麻醉,將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)上分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,經(jīng)頸總動(dòng)脈插管入左心室,以測(cè)左室內(nèi)壓(LVSP),經(jīng)多道生理記錄儀微分計(jì)算左室上升最大速率(+dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)，四肢皮下埋入針式電極觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖，分別記錄0、5、15、25、30 min LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等。

2.2 參附湯入血有效成分對(duì)急性心衰大鼠心肌凋亡、自噬的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌凋亡、自噬。參照文獻(xiàn)報(bào)道的引物序列: Beclin1引物序列：上游5’GGCA GTGGCTCCTATT-3’，下游：5’-GGCGTGCTGTGCTCTGAAAA-3’；Atg5引物序列:上游5’-AGTGGAGGCAACAGAACC-3’,下游5’-GACACG AACTGGCAC ATT-3’； Caspase-3引物序列:上游：5-GCTGGACTGCGGTATTGAG-3’，下游：5’ -CCTGGAACATCGGATTTGATT-3’；β-actin作為對(duì)照,引物序列: 上游引物為5’-CTG TAT GCC TCT GGT CGT AC-3’，下游：5’-TGA TGT CAC GCA TTT CC-3’，產(chǎn)物為470 bp。取50 mg心肌組織,用RNA試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在TaqDNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃40 s,60℃40 s,72℃1 min共35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)左心室收縮壓的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓明顯降低(P<0.01),與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)，陽(yáng)性組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 給藥后對(duì)急性心衰大鼠LVSP的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

3.2 對(duì)左心室內(nèi)壓最大上升速率的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓最大上升速率有明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)，陽(yáng)性組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 對(duì)左心室內(nèi)壓最大下降速率的影響

模型組與空白組比較，左心室內(nèi)壓最大上升速率有明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參附湯水煎液組與參附湯萃取液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽(yáng)性組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，與模型組比較參附湯水煎液組、參附湯萃取液組與陽(yáng)性對(duì)照組Caspase mRNA的表達(dá)量均明顯下降， 與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

3.5 自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示，與模型組比較參附湯水煎液組、參附湯萃取液組與陽(yáng)性對(duì)照組Beclin1、Atg5 mRNA的表達(dá)量均明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 給藥后對(duì)dp/dt max 相對(duì)變化率的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表3 給藥后對(duì)dp/dt min相對(duì)變化率的影響

注：與空白組比較：###P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01

表4 參附湯對(duì)Caspase mRNA，Beclin1、Atg5 mRNA的表達(dá)量影響

4 討論

研究表明，參附湯血中移行成分可保護(hù)缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用[3]；參附湯及其血中移行成分對(duì)大鼠急性心衰具有一定的治療作用，并能調(diào)整心臟的能量代謝[4]。LVSP在一定程度上可以反映心肌收縮力;左心室壓力最大上升速率+dp/dtmax對(duì)變力性因素均高度敏感,反映心肌收縮成分的縮短最大速度,為此在評(píng)價(jià)收縮性能急性改變時(shí)是較好的測(cè)量指標(biāo);與此對(duì)應(yīng)的左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)，反映心肌舒張時(shí)心肌纖維延長(zhǎng)的最大速度,二者是評(píng)價(jià)心肌收縮、舒張性能的常用指標(biāo)[2]。當(dāng)心功能不全時(shí),這些指標(biāo)就會(huì)降低[5]。本研究采用異丙腎上腺素急性心衰模型并加以改良，該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，與臨床心衰病理生理機(jī)制與臨床有相似之處，造模后dp/dtmax顯著下降，且在正常值的20%～40%形成嚴(yán)重的心衰模型，模型組與空白組比較左心室內(nèi)壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率及左心室內(nèi)壓最大下降速率有明顯降低，說明模型成立；參附湯水煎液組、參附湯萃取液組、陽(yáng)性組與模型組比較，左心室內(nèi)壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率及左心室內(nèi)壓最大下降速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。參附湯入血有效成分對(duì)急性心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)有明顯的改善作用,且參附湯水煎液與參附湯萃取液給藥后改善作用比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明了參附湯入血有效成分與萃取液中成分基本一致。caspase-3是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用[6]。Beclin1 是自噬體 (autophagosome) 形成過程中的一個(gè)必需分子，它能夠介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡(phagophore)，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體形成與成熟。在自噬過程中 Beclin1 的表達(dá)水平往往會(huì)上升[7]，自噬相關(guān)基因-5編碼的蛋白Atg5在自噬體的形成過程中參與泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)的形成,對(duì)整個(gè)自噬過程都有極其重要的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌凋亡與自噬相關(guān)基因，結(jié)果表明參附湯入血有效成分可保護(hù)急性心衰大鼠心肌細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用，且與降低Beclin-1、Atg5 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量有關(guān)。

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