顧檢波,王 秀,李 艷

(1.江蘇省常熟市支塘人民醫(yī)院，江蘇 常州 215500； 2.皖南醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002；3.皖南醫(yī)學院附屬戈磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖 241001)

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，早期患者大多無明顯臨床癥狀，70%以上出現(xiàn)癥狀就診的患者已屬疾病晚期，致使肺癌患者5年生存率低[1，2]。對于肺癌患者，化療和放療是主要的治療手段，但相應治療也會對人體產(chǎn)生極大的副作用，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。目前，增效減毒已成為腫瘤學研究的熱點，中醫(yī)藥在此方面發(fā)揮著重要獨特的作用。

“扶正祛邪”法是中醫(yī)治療疾病的常用方法，本文所用的扶正祛邪抗癌方為國醫(yī)大師李濟仁教授及李艷主任醫(yī)師治療晚期肺癌臨床醫(yī)案及相關(guān)用藥經(jīng)驗中精簡化裁出的經(jīng)驗方，在前期的臨床觀察中取得了較好的療效?！皳駮r服用”是李濟仁教授傳承自新安醫(yī)學的獨特經(jīng)驗，為觀察扶正祛邪抗癌方選擇不同時間給藥的治療效果。本實驗在lewis肺癌荷瘤小鼠模型上進行實驗研究，觀察該方對小鼠化療造血功能的影響以及擇時用藥對機體造血水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及瘤株

SPF級雄性C57BL/6近交小鼠60只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于南京青龍山實驗動物中心，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供(合格證號SCXK(蘇)2012～0004)。Lewis肺癌瘤株種鼠由皖南醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.2 試驗藥物及試劑

中藥扶正祛邪抗癌方由黃芪、當歸、黨參、石見穿、白花蛇舌草按7∶3∶3∶2∶2組成，購置于皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院藥房。采用浸泡、煮沸、水浴濃縮等方法制備，生藥含量為1 g/ml，按常人劑量(10 g/60 kg)灌服。P4394-順鉑由上海前塵生物科技有限公司提供，用生理鹽水配置成濃度為0.25 mg/ml的溶液待用。粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素含量采用雙抗體夾心ELISA法檢測，試劑盒由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供。ELx800全自動酶聯(lián)儀購自美國寶特儀器有限公司。

1.3 造模及分組

雄性C57BL/6近交小鼠60只，適應性喂養(yǎng)1周后進行造模。方法為取傳代14 d的荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠，脫頸椎處死，放入75%酒精中浸泡消毒10 min，在無菌條件下剝?nèi)∧[瘤組織，剔除壞死部分和纖維組織置于無菌器皿中。將瘤組織剪成碎片，于組織研磨器中加入4 ml生理鹽水輕輕研磨成組織勻漿液，200目細胞篩過濾，制成單細胞懸液，臺盼藍染色，光鏡下計數(shù)活細胞數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細胞濃度約為1×107/ml。用1 ml的注射器取上述懸液0.2 ml，于空白組外每只小鼠右前肢腋內(nèi)皮下接種。造模后按體質(zhì)量隨機分成空白組、模型組、化療組、辰時中藥+化療組(簡稱辰時組)、午時中藥+化療組(簡稱午時組)、亥時中藥+化療組(簡稱亥時組)6組，每組10只。

1.4 給藥時間及給藥方法

于腋下造模第5天確認造模成功后開始給藥?？瞻捉M不做任何處理，各時辰組灌胃扶正祛邪抗癌方每天1次并腹腔注射順鉑化療隔天1次，化療組腹腔每天上午9∶00注射順鉑化療隔天1次并每天灌胃等量生理鹽水，對照組采取等量生理鹽水灌胃以及腹腔注射持續(xù)2周。中藥擇時灌胃取時為常人早、中、晚(睡前)服藥時間，分別對應十二時辰中辰時(胃經(jīng)旺時：7∶00-9∶00)、午時(心經(jīng)旺時：11∶00-13∶00)、亥時(三焦經(jīng)旺時：21∶00-23∶00)。

1.5 標本制備及指標檢測

各組小鼠用藥結(jié)束后第2天開始收集標本，摘眼球取血收集血標本，分別裝入加EDTA抗凝管中及2 mlEP管中。其中2 mlEP管中血液在冷藏15 min后給予離心機3000 r/min，離心15 min取上層血清，-20 ℃冰箱保存待測。而EDTA抗凝管中血液迅速用于紅細胞和白細胞計數(shù)。處死小鼠后進行骨髓標本制備，來源于小鼠完整左側(cè)股骨，制備的骨髓細胞液放入5 mlEP管中待測。小鼠血清粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)含量測定嚴格按照說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況影響

本次實驗小鼠60只，死亡2只，為模型組、化療組各死亡1只。實驗初，各組小鼠進食、飲水、活動等一般狀況差異無統(tǒng)計學意義。造模后第5天，除空白組外各組小鼠腋下均可及直徑約2～5 mm硬結(jié)，成瘤率100%。隨著用藥時間的推移和腫瘤的增長，模型組、化療組、各時辰用藥組小鼠進食、進水、清理皮毛等活動均有減少，小鼠精神萎靡，被毛無光，喜歡群聚。而空白組小鼠進食、飲水等一般狀況無明顯改變。

2.2 小鼠外周血白細胞和紅細胞比較

表1顯示，與模型組比較，化療組及辰時組、午時組的白細胞和紅細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與化療組比較，各時辰用藥組的白細胞計數(shù)有所回升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與午時組比較，亥時組的白細胞計數(shù)回升較明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而紅細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各實驗組小鼠外周血白細胞和紅細胞計數(shù)比較

注：與模型組比較：★P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與午時組比較：○P<0.05

2.3 小鼠骨髓有核細胞比較

表2顯示，與模型組比較，化療組及辰時組、午時組、亥時組的骨髓有核細胞計數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；熃M骨髓有核細胞計數(shù)下降均最為明顯，與化療組比較，各時辰組均有不同回升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與辰時組及午時組比較，亥時組骨髓有核細胞計數(shù)回升較明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各實驗組小鼠骨髓有核細胞計數(shù)比較

注：與模型組比較：★P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與午時組比較：○P<0.05

2.4 小鼠血清EPO、G-CSF含量比較

表3顯示，各實驗組小鼠血清EPO、G-CSF含量均出現(xiàn)不同程度下降，與模型組比較，化療組血清EPO、G-CSF含量下降最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與化療組比較，亥時組血清EPO、G-CSF含量明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而各時辰用藥組血清EPO、G-CSF含量均出現(xiàn)不同程度回升，與辰時組比較，亥時組血清G-CSF含量回升較明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而亥時組血清EPO含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各實驗組小鼠血清G-CSF、EPO含量比較

注：與模型組比較：P<0.05；與化療組比較：△P<0.05，與辰時組比較：○P<0.05

3 討論

中醫(yī)治療惡性腫瘤的主要法則是“扶正祛邪化毒”，而肺癌患者本身機體?？沙霈F(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，故在治療中應增強患者免疫力，提高機體抗腫瘤能力[3，4]。扶正祛邪抗癌方由當歸、黃芪、黨參、白花蛇舌草、石見穿5味藥物組成。方中重用黃芪為君，意在補氣生血、實衛(wèi)固表；用當歸、黨參為臣，當歸補血和營，黨參補脾肺氣兼而補血，兩者配合黃芪氣血雙補，使補氣扶正，氣旺血生，陽有所附；白花蛇舌草、石見穿為佐，兩藥清熱解毒、消腫散結(jié)，用以消散癌腫，使邪去正安。全方配合使用，適用于治療晚期肺癌尤其是肺癌化療后所致虛實夾雜之證。

中醫(yī)時間醫(yī)學是國醫(yī)大師李濟仁及其弟子胡建北在國內(nèi)較早開展的研究項目，并取得了較好的成果?！皬娬{(diào)服藥時間，注重動靜宜忌”；“推崇數(shù)方并用，主張定時分服”是其主要學術(shù)思想之一。本研究中扶正祛邪抗癌方可減輕化療所引起的骨髓抑制，表現(xiàn)在各時辰用藥組外周血白細胞、紅細胞以及骨髓有核細胞數(shù)目均出現(xiàn)不同程度回升，表明扶正抗癌祛邪方可以減輕化療藥物所引起的骨髓抑制，對骨髓造血功能具有保護作用。其中亥時用藥組中亥時組外周血白細胞、紅細胞以及骨髓有核細胞數(shù)目回升最為明顯，與其他時辰用藥組比較差異有統(tǒng)計學意義，表明不同時段服用扶正抗癌祛邪方對小鼠外周血及骨髓造血功能具有不同影響。而針對白細胞、紅細胞以及骨髓有核細胞數(shù)目回升的不同，考慮與各系細胞增殖周期相關(guān)。

血細胞的產(chǎn)生源于骨髓造血干細胞，而一些作用于造血前體細胞的造血生長因子可以促進骨髓造血細胞的增殖和分化，促進各系幼稚細胞成熟，如EPO和G-CSF、GM-CSF、IL-3等。實驗發(fā)現(xiàn)，一些中草藥可以提高人體血清中造血生長因子如EPO、G-CSF等的表達，進而促進骨髓造血。臨床常用于骨髓抑制后造血功能修復的中藥有黃芪、當歸、黨參等。黃芪的主要有效成分為黃芪多糖，研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可提升腫瘤患者免疫功能[5]，并能提高患者生活質(zhì)量，延長生存時間[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對注射環(huán)磷酰胺引起的小鼠骨髓抑制模型的造血功能具有修復作用，黃芪多糖可明顯增加實驗小鼠骨髓細胞及外周血細胞計數(shù)，且存在一定的量效關(guān)系[7]。當歸多糖對造血功能的亦有不錯保護效果[8]。有研究指出，經(jīng)當歸多糖誘導的骨髓巨噬細胞培養(yǎng)后上清液可以提升髓系造血祖細胞集落產(chǎn)生率，其表達的EPO、GM-CSF、IL-3、IL-6蛋白水平均出現(xiàn)不同程度的提高，而EPO mRNA以及GM-CSF mRNA的表達水平明顯提高，證明當歸多糖可以直接或間接刺激造血，誘導微環(huán)境中的骨髓巨噬細胞從基因和蛋白水平上促進造血因子的合成與分泌[9]。有學者認為，當歸多糖對造血動員的調(diào)控可能與降低造血細胞表面某些黏附分子表達相關(guān)[10]。本研究化療組EPO、G-CSF含量下降，提示化療可引起造血生長因子EPO、G-CSF表達的降低，而扶正祛邪抗癌方可以影響小鼠血清中EPO、G-CSF的表達，表現(xiàn)為各時辰用藥組EPO、G-CSF含量的回升。同時本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，亥時用藥組小鼠G-CSF含量回升最明顯，表明不同時段用藥對機體造血功能產(chǎn)生不同影響，而時間醫(yī)學在腫瘤治療中應用的目的就在于使化療中選擇藥物對腫瘤細胞殺傷最強而對正常組織損傷最小的時間治療，以及選擇促進化療后組織恢復的最佳時間進行治療。我們認為其可能與擇時用藥促進造血因子的釋放，不同時段骨髓造血前體細胞對造血因子的敏感不同相關(guān)，其具體機制尚需進一步研究。

[1] 李瑞娜. 肺癌流行病學和病因?qū)W研究[J].實用醫(yī)學雜志,2009,25(11): 1904-1905.

[2] 陳仁杰,張金良,闞海東.中國大氣污染與肺癌關(guān)系的流行病學研究回顧[J].衛(wèi)生研究,2011,40(2):243-245.

[3] 李艷.扶正祛邪化毒法在腫瘤治療中的應用[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2009,21(6): 487-489.

[4] 單保恩.IL-12家族細胞因子:腫瘤免疫治療研究的熱點分子[J]. 中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(3):239-244.

[5] 邢秀玲,田菲,賈文娟. 注射用黃芪多糖對晚期肺癌患者生活質(zhì)量的影響[J].河南中醫(yī),2009,29(3):262-263.

[6] 金璋,沈潔.注射用黃芪多糖對II-III期非小細胞肺癌放療患者免疫功能的影響[J].中草藥,2009,40(4):611-612.

[7] 徐尚福,楊天華,吳芹,等.黃芪多糖對環(huán)磷酰胺引起小鼠骨髓抑制后造血功能的修復作用[J]. 遵義醫(yī)學院學報,2011,34(5):473-476.

[8] 何曉莉,張雁,吳宏,等.當歸多糖對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護作用的研究[J].重慶醫(yī)學, 2012,41(35):3724-3736.

[9] 李靜,王亞平.當歸多糖對骨髓巨噬細胞的影響及其與造血調(diào)控的關(guān)系[J]. 中草藥,2005,36(1):69-72.

[10] 杜小麗,王改琴,吳宏. 當歸多糖對小鼠造血細胞表面黏附分子表達的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報,2008,33(3):274-276.

[11] 胡劍北.中西醫(yī)結(jié)合時間治療學[M].合肥：安徽科技出版社，2008：5.