賀婕 彭貴海 黃琪 李德梅

枸杞多糖對(duì)Aβ1～40誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退的影響

賀婕 彭貴海 黃琪 李德梅★

目的探討枸杞多糖（LBP）對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退的影響。方法SD健康大鼠隨機(jī)分為5組：AD模型組，LBP 高、中、低劑量干預(yù)組，空白對(duì)照組，每組24只。通過(guò)雙側(cè)海馬注射Aβ1～40，建立AD大鼠模型。采用LBP連續(xù)灌胃6周作用于AD大鼠，觀察各組大鼠行為學(xué)、海馬SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的變化。結(jié)果（1）與AD模型組比較，LBP低、中、高劑量組潛伏期明顯縮短、過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。（2）與AD模型組比較，LBP低、中、高劑量組海馬SOD、GSH-Px活性明顯升高、MDA含量明顯降低（P＜0.05）。（3）與AD模型組比較，LBP低、中、高劑量組齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多（P＜0.05）。（4）LBP中、低劑量組比較，上述各指標(biāo)均有明顯差異（P＜0.05）。LBP高、中劑量組比較，上述各指標(biāo)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論LBP可能通過(guò)提高海馬SOD、GSH-Px活性、降低MDA含量以及增強(qiáng)齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

阿爾茨海默病 枸杞多糖 學(xué)習(xí)記憶 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 丙二醛 5-溴脫氧尿嘧啶核苷

阿爾茨海默?。ˋ1zheimer’s disease，AD）是一種嚴(yán)重危害中老年人身心健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前臨床上治療AD的西藥主要是針對(duì)AD的某一特定病理環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，其效果均不理想［1］。近年來(lái)中藥多靶點(diǎn)干預(yù)AD過(guò)程、引起了越來(lái)越多的關(guān)注［2］。本研究，通過(guò)海馬注射β淀粉樣蛋白1～40（Aβ1～40）建立AD大鼠模型，采用枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）連續(xù)灌胃作用于AD模型大鼠，觀察各組大鼠行為學(xué)、海馬超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量以及5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)的變化，探討LBP對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，SPF級(jí)，12個(gè)月齡，體重490～510g，均由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Aβ1～40（Biosource）；BrdU和大鼠抗BrdU單克隆抗體（Sigma）；LBP（寧夏啟元，純度＞98%）；SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒和MDA試劑盒（武漢博士德）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2012年4月至10月。

1.2 復(fù)制SD大鼠AD模型［3，4］將Aβ1～40溶于無(wú)菌生理鹽水（5μg/ml），放入37℃溫箱孵育2周，使其變成絲狀聚集狀態(tài)。取SD正常大鼠，用35g/L的戊巴比妥鈉（35g/kg）將其分別麻醉后，按包新民等編著大鼠腦立體定位圖譜、用江灣-I型C通用立體定向器定位：（AP-3.5mm，ML±2.0mm，DV2.7mm）即為海馬注射點(diǎn)（以前囟定位，向后3.5mm，旁開(kāi)2.0mm，向下2.7mm）。雙側(cè)海馬注射2μl（10μg）Aβ1～40，10min內(nèi)注完，并留針10min。Aβ1～40海馬注射后第7天，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元以及Aβ斑或老年斑（SP），若符合AD病理特征，則該批大鼠認(rèn)定為AD模型鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及LBP干預(yù)方法 將AD模型大鼠隨機(jī)分為4組：AD模型組、LBP高、中、低劑量干預(yù)組，每組24只；另取SD健康大鼠24只確定為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)對(duì)象共計(jì)5組。將LBP用生理鹽水分別配制為2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml的混懸液。LBP低、中、高劑量組給予 LBP 20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg 灌胃，連續(xù)6周；空白對(duì)照組與 AD 模型組則同時(shí)給予等量的生理鹽水灌胃。

LBP干預(yù)結(jié)束后行Morris水迷宮測(cè)試［3，4］。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)5d，從第1天起，每天分上、下午各訓(xùn)練1次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，讓大鼠尋找、游向并爬上平臺(tái)，記錄其潛伏期、運(yùn)行時(shí)間。（2）空間搜索實(shí)驗(yàn)：在第6天撤除水下平臺(tái)，記錄大鼠在120s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)和第一次通過(guò)平臺(tái)的時(shí)間。在行為學(xué)測(cè)試的后3d，對(duì)各組動(dòng)物同步進(jìn)行BrdU腹腔注射（50mg/kg，3次/d，12h完成）。

1.4 測(cè)定SOD、GSH-Px活性和MDA含量 行為學(xué)測(cè)試后，每組大鼠取8只斷頭處死，立即于冰浴上取出全腦，在前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm處分離出海馬，用生理鹽水清洗，立即放入液氮中保存。測(cè)定時(shí)取出稱(chēng)量、剪碎，按重量體積比（W/V）1：9加入冰生理鹽水，通過(guò)高速電動(dòng)勻漿機(jī)、制成10%海馬組織勻漿液，4℃、3000 r/min離心15 min，取上清分裝到EP管中；嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次測(cè)定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.5 組織切片制備、染色與計(jì)數(shù) 按照凌雁武［4］等方法，將每組大鼠取8只麻醉，先后灌洗、固定、取腦、后固定以及包埋，并行冷凍切片（連續(xù)冠狀），片厚6μm。BrdU免疫組織化學(xué)染色方法：按免疫組化常規(guī)程序進(jìn)行，特別注意入大鼠抗BrdU單克隆抗體（1：100）室溫孵育2h，然后 4℃下過(guò)夜；陰性對(duì)照結(jié)果為陰性。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每只大鼠取5張切片，含DG對(duì)應(yīng)部位并在5組間保持?jǐn)嗝嬉恢?；光鏡下計(jì)算每張隨機(jī)10個(gè)視野中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、取其平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果，再取5張平均值為最后結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料描述用（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化 LBP干預(yù)前，AD模型組較空白對(duì)照組潛伏期延長(zhǎng)、過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.01），即模型制作成功。干預(yù)結(jié)束后，LBP低劑量組較AD模型組潛伏期縮短、過(guò)平臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.05），LBP中劑量組前者進(jìn)一步縮短、后者進(jìn)一步增加（P＜0.05）；但LBP高、中劑量組上述兩指標(biāo)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期與過(guò)平臺(tái)次數(shù)

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期與過(guò)平臺(tái)次數(shù)

注：與AD模型組比較：*P＜0.05

組別只LBP干預(yù)前LBP干預(yù)結(jié)束后潛伏期（s）過(guò)平臺(tái)次數(shù)潛伏期（s）過(guò)平臺(tái)次數(shù)AD模22445.51±4.363.22±0.3143.10±4.233.09±0.28 LBP低劑量組2444.63±4.403.34±0.2932.68±3.39*5.13±0.49*LBP中劑量組2446.12±4.543.50±0.3224.15±2.266.79±0.68 LBP高劑量組2445.33±4.293.43±0.3623.87±2.176.81±0.71空白對(duì)照組2418.32±1.728.31±0.7819.43±1.898.31±0.78

2.2 5組大鼠SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果 AD模型組較空白對(duì)照組SOD、GSH-Px活性降低、MDA含量升高（P＜0.01），說(shuō)明模型制作成功；LBP低劑量組較AD模型組SOD、GSH-Px活性升高、MDA含量降低（P＜0.05），LBP中劑量組前兩者活性進(jìn)一步升高、后者進(jìn)一步降低（P＜0.05）；但LBP高、中劑量組上述三指標(biāo)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果（x±s）

2.3 5組大鼠齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 從光學(xué)顯微鏡下，BrdU免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色、位于細(xì)胞核內(nèi)。各組大鼠齒狀回的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)多樣，有圓形、橢圓形和梭形等；大多數(shù)分布在齒狀回的顆粒細(xì)胞下層（subgranular zone，SGZ），少量分布在顆粒細(xì)胞層。從表2可以看出，AD模型組較空白對(duì)照組齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少（P＜0.05），LBP低劑量組較AD模型組表達(dá)增多（P＜0.05），LBP中劑量組表達(dá)進(jìn)一步增多（P＜0.05）；但LBP高、中劑量組上述指標(biāo)表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

Aβ在腦內(nèi)沉積、形成SP是AD的發(fā)病基礎(chǔ)，其中心環(huán)節(jié)是大量的、絲狀的具有神經(jīng)毒性的Aβ，引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與死亡。SP最初集中在以海馬結(jié)構(gòu)、內(nèi)嗅區(qū)為核心的邊緣系統(tǒng)，最終大腦皮層廣泛受累［4］。本研究結(jié)果顯示，海馬注射Aβ1～40后，大鼠產(chǎn)生了類(lèi)似于AD的學(xué)習(xí)記憶減退，說(shuō)明本模型較好地模擬了AD認(rèn)知障礙的病理基礎(chǔ)，即海馬結(jié)構(gòu)和功能的損害，導(dǎo)致大鼠短期記憶缺失。LBP對(duì)AD模型鼠干預(yù)后，其潛伏期明顯縮短、穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加，表明LBP可以改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

SOD、GSH-Px是兩種重要的抗氧化酶，它能保護(hù)腦組織避免遭受自由基的氧化性損傷；MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，它的含量代表著脂質(zhì)過(guò)氧化水平。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，海馬注射Aβ1～40后，其海馬組織SOD和GSH-Px活性降低、MDA含量顯著升高，說(shuō)明Aβ海馬注射后發(fā)生了較強(qiáng)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的自由基，造成海馬組織損傷。LBP能明顯減輕AD大鼠海馬組織損傷，提高海馬組織中SOD和GSH-Px活性并降低MDA含量，加速自由基清除，減輕自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，證實(shí)LBP通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性而拮抗Aβ的氧化損傷。在生理情況下，機(jī)體氧自由基（ROS）的產(chǎn)生和SOD、GSH-Px等抗氧化酶類(lèi)對(duì)ROS清除間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。海馬注射Aβ1～40后，Aβ在機(jī)體生物膜上產(chǎn)生氧化應(yīng)激及ROS，攻擊多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）；同時(shí)，改變膜通透性和膜電位，開(kāi)放電壓依賴(lài)性鈣通道，促使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。大量Ca2+可激活膜蛋白酶和磷脂酶，產(chǎn)生游離脂肪酸并溶解磷脂，并導(dǎo)致花生四烯酸（AA）釋放，反應(yīng)過(guò)程中可進(jìn)一步形成大量新的自由基，形成惡性循環(huán)，造成組織損傷進(jìn)一步惡化［5～7］。

本研究結(jié)果還顯示，與空白對(duì)照組比較，AD 模型組海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層（SGZ）神經(jīng)發(fā)生受到顯著性抑制、學(xué)習(xí)記憶能力下降；提示AD 模型大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生受抑制可能是導(dǎo)致其記憶能力減退原因之一。與 AD 模型組比較，LBP 干預(yù)組海馬 SGZ的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著性增加，提示 LBP可以促進(jìn)AD模型大鼠齒狀回SGZ神經(jīng)發(fā)生。LBP是中藥枸杞子的重要有效成分，近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化等多種生理活性［8，9］。海馬齒狀回SGZ的神經(jīng)發(fā)生與學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系研究，已有不少報(bào)道，研究表明，在正常情況下神經(jīng)發(fā)生參與了學(xué)習(xí)記憶功能的形成與調(diào)整，神經(jīng)發(fā)生越多、學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，呈正相關(guān)性［10］。本研究結(jié)果另顯示，LBP可以改善這一過(guò)程，且具有量-效關(guān)系，表明LBP可能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，促進(jìn)AD模型海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生，從而改善 AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

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ObjectiveTo investigate the effect of lycium barbarum polysaccharide （LBP） on Alzheimer's disease （AD）-induced learning and memory decline in rats.MethodsThe healthy SD rats were randomly divided into 5 groups： AD model group，low，medium and high-dose LBP treatment group，and control group，with 24 rats in each group. Aβ1～ 40 was injected into bilateral hippocampi to construct the AD rat model. The gastric lavage with LBP was performed for six consecutive weeks in AD rats. The variations of the behavior，the activities of antioxidant enzyme and malondiadehyde （MDA） content and expression of BrdU-labelled positive cells of each group were observed.Results（1）The latency was obviously shortened for low，medium and highdose LBP treatment groups，while the number of crossing the platform was signif cantly increased，compared with the AD model group （P＜0.05）。（2）The hippocampal SOD and GSH-Px activities were signif cantly increased and the MDA content decreased significantly for low，medium and high-dose LBP treatment groups （P＜0.05）； compared with AD model group。（3）The expression of BrdU-labelled positive cells in all treatment groups were signif cantly increased，compared with the AD model group（P＜0.05）。（4）All the indicators above showed signif cant variance between low-dose and medium-dose LBP groups（P＞0.05）；but no signif cance in the indicators stated above was detected between high-dose and medium-dose LBP treatment groups （P＞0.05）.ConclusionLBP relieves the AD-induced memory and learning decline in rats by enhancing the hippocampal SOD and GSH-Px activities，reducing the MDA content and promoting the BrdU-labelled positive cells in the dentate gyrus in the hippocampi.

Alzheimer's disease Lycium barbarum polysaccharide Learning and memory SOD GSH-Px MDA BrdU

2012年湖北省教育廳科研項(xiàng)目(Q20122403)

442000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院老年病科（賀婕 彭貴海）

442000 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（黃 琪）

442000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院老年病科（李德梅）*