于海云，姚艷，張銀輝，龔菁，黃健，浦介麟

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

不同濃度藥物PTC124和G418對HERG通道無義突變體的作用*

于海云，姚艷，張銀輝，龔菁，黃健，浦介麟

目的： 通過對HERG基因無義突變體應(yīng)用不同劑量PTC124和G418來觀察其通道功能的恢復(fù)情況，并探討藥物的作用機(jī)制。

方法： 制備HERG基因R1014X突變體，將野生型（WT）HERG及R1014X分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后將其置入含不同濃度的PTC124和G418的培養(yǎng)液中孵育24 h。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測各組細(xì)胞HERG信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)，蛋白印跡法檢測野生型和R1014X給藥前后通道蛋白的表達(dá)，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄通道電流以評價(jià)HERG基因編碼通道的功能性表達(dá)。

結(jié)果：與野生型相比，R1014X突變體編碼的通道蛋白的蛋白條帶變短，蛋白量及mRNA水平無明顯差異（P＞0.05）。藥物PTC124和G418均能恢復(fù)R1014X完整蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴性變化（P＜0.05），PTC124的作用弱于G418（P＜0.05）。藥物干預(yù)后，R1014X突變體HERG通道的功能得到不同程度的恢復(fù)，其最大尾電流密度由（4.75±0.88）pA/pF分別增加至（9.62±0.73） pA/pF （PTC124， P＜0.05）和（22.57±2.26） pA/pF （G418, P＜0.05），G418作用使通道的半激活電壓得到恢復(fù)（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論： 藥物PTC124和G418能不同程度恢復(fù)HERG基因無義突變的結(jié)構(gòu)和功能性表達(dá)，其恢復(fù)HERG基因的蛋白表達(dá)呈劑量依賴性變化。

HERG；無義突變； PTC124；遺傳性心律失常

Methods: The wide type (WT) and R1014X mutant of HERG gene were transiently transfected into HEK293 cells for 24 hours, and the cells were cultured with pharmaceuticals of PTC124 and G418 at different concentrations respectively for 24 hours. HERG mRNA expression was examined by RT-PCR, HERG WT and R1014X mutant protein expressions were detected by Western blot analysis, HERG channel function was evaluated by patch clamping recorded current fl ow.

Results: Compared with WT HERG, the R1014X mutant showed shorter protein zone in HERG channel protein, while the expressions of mRNA and protein were similar between WT and mutant, P＞0.05. Both PTC124 and G418 may recover the entire protein expression of R1014X mutant in a dose-dependent model, P＜0.05, and the effect of PTC124 was weaken than that of G418, P＜0.05. With pharmaceutical intervention, the R1014X mutant of HERG channel function

may recover at different degrees, the maximal tail current densities of R1014X channels increased from (4.75±0.88 ) pA/pF to (9.62±0.73) pA/pF by PTC124, P＜0.05 and to (22.57±2.26) pA/pF by G418, P＜0.05. The G418 recovered the semi-activation voltage of HERG channels, P＜0.05.

Conclusion: Both pharmaceuticals of PTC124 and G418 could recover the structure and function of HERG channel in nonsense mutation at different degree; they recover HERG channel protein expression in a dose-dependent model.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:461.)

HERG（human ether-a-go-go-related gene）基因編碼心臟快速激活延遲整流鉀電流（Ikr）通道的α亞基，在心臟復(fù)極化過程中具有重要作用[1]。該基因突變可引起Ikr通道電流異常，導(dǎo)致2型長QT 綜合征（LQT2）的發(fā)生，后者為一類遺傳性心律失常，可導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的暈厥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致猝死[2,3]。大約10%的HERG基因突變?yōu)闊o義突變[4,5]，即HERG基因中引入了提前發(fā)生的終止密碼子（premature termination codons, PTCs），導(dǎo)致蛋白的翻譯提前終止生成不完整的功能異常的通道蛋白。

在對囊性纖維化、Duchenne肌發(fā)育不良（DMD）等其他無義突變所致疾病的研究中發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素可以通過提高CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）基因、Duchenne肌發(fā)育不良基因無義突變體的翻譯通過率，產(chǎn)生全長有功能的蛋白，從而恢復(fù)突變體的結(jié)構(gòu)和功能[6-8]。我們先前的研究證實(shí)藥物G418和慶大霉素在表達(dá)HERG基因R1014X突變體的HEK293細(xì)胞中可以部分恢復(fù)HERG樣電流[9]，但是藥物G418對HERG基因編碼通道的恢復(fù)是否與劑量相關(guān)及發(fā)揮最大作用時(shí)藥物的劑量尚不明確。

PTC124 （Ataluren）是一種新合成的小分子化合物，實(shí)驗(yàn)證實(shí)它也可以抑制PTCs，使蛋白翻譯繼續(xù)，生成完整的有功能的蛋白質(zhì)，因此被認(rèn)為是治療無義突變所致基因疾病的一種新選擇[10]。該化合物在囊性纖維化、Duchenne肌發(fā)育不良等無義突變疾病模型中已得到驗(yàn)證[11,12]，但是其在HERG鉀通道無義突變中的研究少見報(bào)道。

本研究于2012-02至2013-04通過制備HERGR1014X無義突變體并使不同濃度藥物（PTC124、G418）作用于該突變體，應(yīng)用生物化學(xué)方法及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測給藥前后HERG通道蛋白表達(dá)和功能的變化，探討不同藥物對HERG基因無義突變體的作用。

1 材料與方法

主 要 試 劑：DMEM（Dulbcco’s Modifed Eagle Medium）高糖培養(yǎng)基、核糖核酸（RNA ）提取試劑TRIzoL Reagent購自美國Invitrogen公司，G418、PTC124購自美國Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑（Ef fectene Transfection Reagent）購自德國 Qiagen 公司，HERG抗 N端及 C 端抗體購自以色列 Alomone公司。BCA試劑盒購自中國碧云天公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄酶購自瑞士Promega公司， SYBR?GREEN PCR Master Mix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。

HERG基因突變體制備及細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HERG基因野生型（Wide type, WT）質(zhì)粒為美國俄勒岡大學(xué)周正鋒教授贈送，采用聚合酶鏈反應(yīng)的方法制備R1014X突變體，并進(jìn)行基因測序驗(yàn)證序列的正確性。將野生型及R1014X分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后將其置入含不同藥物濃度的PTC124和G418的培養(yǎng)液中孵育24 h。

實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量。引物：HERG基因： （上游） 5'-GCTTGCTCAACTCCACCTC-3'， （下游） 5'-TTTGGGGAATCTTGCTAATG-3'；GAPDH： （上游）5'-CCCTTCATT GACCTCAACTACATG-3'，（下游）5'-CTTCTC CATGGTG GTGA AGAC-3'。熒光染料技術(shù)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μl）包括SYBR?GREEN PCR Master Mix 10 μl、引物（上游0.5 μl、下游 0.5 μl）、超純水8 μl、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA） 1 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 2 min起始模板變性；94℃ l5 s、58℃ 30 s、72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，計(jì)算機(jī)分析反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到系統(tǒng)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)即Ct 值，相對定量法比較野生型及R1014X基因的表達(dá)。

蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測：提取總蛋

白：使用預(yù)冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞3遍，吸干后加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），將細(xì)胞刮下移至預(yù)冷的EP管，冰上放置20 min后，4℃下13 000 g/ min，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，BCA法測定蛋白濃度，加loading buffer 70℃溫浴5 min。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加抗HERG N端及C端抗體，4℃孵育過夜；TBST緩沖液沖洗3次，每次5 min，加辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗兔抗，室溫孵育1.5 h，TBST緩沖液沖洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)：應(yīng)用全細(xì)胞記錄的方式記錄給藥前后各組細(xì)胞HERG電流的表達(dá)。細(xì)胞外液成分（in mM）：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2，1 MgCl26 H2O，10 glocose，10 HEPES。電極內(nèi)液（in mM）：140 KCl，0.5 MgCl26 H2O，5 HEPES，2 EGTA，4 K2ATP。記錄HERG電流穩(wěn)態(tài)激活I(lǐng)-V的方案為維持電壓（Vh）從-80 mV，測試電壓（Vt）從-60 mV開始，以10 mV階躍刺激至+50 mV，繼而復(fù)極到-50mV記錄尾電流，波寬4 000 ms，采樣頻率2 kHz。實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行，以pCLAMP 10.0分析采集的電流數(shù)據(jù)。電流密度以電流值除以細(xì)胞電容得出。標(biāo)準(zhǔn)化尾電流后通過Boltzmann公式（I/Imax=1/（1+exp[（V1/2-V）/k]）擬合得到通道的半激活電壓（V1/2）和斜率因子（k）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計(jì)軟件分析，連續(xù)性變量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1無義突變影響了HERG基因編碼的蛋白表達(dá)及HERG通道的功能，轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化

應(yīng)用HERG基因編碼蛋白的N-末端抗體，野生型HERG基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)檢測出兩條蛋白條帶，155 kDa和135 kDa的條帶分別代表復(fù)合糖基化的成熟形式和核心糖基化的未成熟形式；在表達(dá)HERG基因R1014X突變體的細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了兩條分子量低于野生型HERG基因編碼蛋白的條帶（140 kDa和120 kDa），分別代表成熟和未成熟形式。野生型和R1014X突變體內(nèi)HERG基因的信使核糖核酸（mRNA）水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HERG的mRNA水平幾乎檢測不到（圖1A，P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。野生型和R1014X突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HERG基因的蛋白表達(dá)量未見明顯差異（圖1B，P＞0.05）。

圖1 野生型及R1014X突變體mRNA及蛋白的表達(dá)

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了轉(zhuǎn)染野生型HERG基因和R1014X突變體在HEK293細(xì)胞內(nèi)的電流，R1014X能表達(dá)HERG樣電流，但是與野生型HERG基因相比，其最大尾電流幅值明顯下降[（4.75±0.88） pA/pF， n=7 vs （52.83±4.01） pA/pF, n=10, P＜0.05] ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖2）

圖2 野生型及R1014X突變體電流的表達(dá)

2.2不同濃度藥物PTC124和G418部分恢復(fù)了HERG基因R1014X突變體內(nèi)HERG全長功能蛋白的表達(dá)

為了研究拯救效率，我們應(yīng)用了HERG基因編碼蛋白的C末端抗體。使用該抗體時(shí)，只有R1014X突變體得到拯救，135 kDa和155 kDa的兩條蛋白條帶才能顯現(xiàn)，代表著全長功能蛋白表達(dá)的

恢復(fù)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果發(fā)現(xiàn)：直接檢測HERG基因R1014X突變體時(shí)，未發(fā)現(xiàn)蛋白條帶。應(yīng)用藥物PTC124干預(yù)后，出現(xiàn)了與野生型一致的蛋白條帶，代表著全長功能蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且，該表達(dá)具有劑量依賴性的變化（P＜0.01），隨著藥物劑量（0、10、50、200 μmol/L）的增加，蛋白的表達(dá)也逐漸增加[0、（2.9±0.6）%、（7.6±0.5）%、（10.3±1.0）%]。（圖3）

應(yīng)用藥物G418干預(yù)后HERG基因編碼蛋白的表達(dá)也出現(xiàn)劑量依賴性的增加（P＜0.05），在劑量為400 μg/ml時(shí)，全長功能蛋白的表達(dá)量最多（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖3）

圖3 PTC124和G418對R1014X作用的濃度依賴性

2.3藥物PTC124和G418不同程度恢復(fù)了R1014X突變體的功能性表達(dá)

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測藥物干預(yù)后R1014X突變體的電流密度和激活動力學(xué)特性的變化：與未處理的突變體[（4.75±0.88 ）pA/pF, n=7]相比，藥物 PTC124（200 μg/ml）干預(yù)后最大尾電流密度明顯增加[（4.75±0.88 ）pA/pF to （9.62±0.73）pA/pF, n=7, P＜0.05]，但是仍然低于野生型HERG基因編碼通道[（52.83±4.01）pA/pF, n=10，P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖4）

藥物G418（400 μg/ml）干預(yù)后最大尾電流密度也明顯增加（22.57±2.26） pA/pF, n=6, P＜0.05）；其激活曲線左移也得到了糾正[V1/2 = （12.05±1.93） mV vs V1/2 =（ 0.20±1.13）mV, P＜0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖4）

圖4 PTC124和G418對R1014X的作用效應(yīng)

3 討論

長QT綜合征指具有心電圖上QT間期延長，T波異常，易產(chǎn)生室性心律失常、暈厥和猝死的一組綜合征[13,14]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)13種基因突變可以導(dǎo)致長QT綜合征的發(fā)生。HERG基因編碼通道屬于一種進(jìn)化保守的電壓依賴性鉀通道Eag家族的成員，是遺傳性長QT綜合征的致病基因之一。HERG通道是由4個(gè)相同的α亞基組成的四聚體組成電壓門控性鉀通道的典型結(jié)構(gòu)。除了跨膜結(jié)構(gòu)部分，HERG通道還有一個(gè)N末端和一個(gè)C末端，均位于細(xì)胞內(nèi)。N末端缺失后會導(dǎo)致通道加速滅活，推測其與通道的滅活過程調(diào)節(jié)有關(guān)；C末端從第667位氨基酸殘基延伸至第1159 位氨基酸殘基，含有環(huán)核苷酸結(jié)合域（CNBD），與HERG基因編碼通道蛋白的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究中的 HERG基因R1014X突變體為C端突變。R1014X 突變體的C端雖被截短，但仍能表達(dá)典型的HERG樣電流[15]。我們的研究比較了野生型及R1014X 突變體HERG mRNA的表達(dá)，在兩組中未見明顯差異，說明R1014X突變體mRNA未受到無義突變介導(dǎo)的mRNA降解（NMD效應(yīng)）[16]，NMD效應(yīng)是指基因在引入無義突變后顯著降低mRNA的穩(wěn)定性從而引起mRNA的降解[17]。所以，藥物G418和PTC124主要是在翻譯水平影響蛋白的表達(dá)。

氨基糖苷類抗生素是一類歷史悠久的抗生素，主要分為兩大類：4，5-二脫氧鏈霉胺衍生物和4，

6-二脫氧鏈霉胺衍生物，后者主要包括G418、慶大霉素等。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素能夠提高無義突變的翻譯通過率，恢復(fù)蛋白的表達(dá)和功能[8,18]，課題組前期研究也已證實(shí)氨基糖苷類抗生素能夠恢復(fù) R1014X 突變體的全長功能蛋白的表達(dá)[9]。本研究通過不同劑量的G418作用于R1014X突變體，發(fā)現(xiàn)了其作用具有劑量依賴性，隨著劑量的加大，恢復(fù)能力也逐步增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了氨基糖甙類藥物對無義突變體干預(yù)的有效性。

氨基糖苷類抗生素在發(fā)揮作用的同時(shí)，可產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其中最嚴(yán)重的是耳毒性和腎毒性。此外，還會產(chǎn)生神經(jīng)肌肉阻滯作用及變態(tài)反應(yīng)等不良反應(yīng)，限制了臨床上大劑量和長療程的用藥[19]。最近的研究發(fā)現(xiàn)PTC124，一種小分子化合物，可以作為新型的無義突變抑制劑產(chǎn)生作用[20,21]。經(jīng)過PTC124治療的Duchenne肌發(fā)育不良患者和小鼠肌管中可檢測出抗肌萎縮蛋白的表達(dá)，其用藥的濃度小于慶大霉素和G418[10]。我們的研究首次證實(shí)PTC124在R1014X突變體中恢復(fù)了HERG基因編碼全長功能蛋白的合成，并且其發(fā)揮作用具有劑量依賴性。

各種藥物對于無義突變的拯救具有不同的效率。有研究報(bào)道PTC124在治療囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因無義突變導(dǎo)致的囊性纖維化的過程中優(yōu)于慶大霉素和G418等氨基糖苷類抗生素[21]，但也有研究認(rèn)為PTC124在治療無義突變導(dǎo)致的代謝性疾病中未發(fā)揮明顯作用[22]。本研究觀察到PTC124對于HERG基因的無義突變有拯救作用，但是效果不及G418。這可能是由于PTC124對不同疾病的無義突變基因存在親嗜性所致，其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

總之，本研究首次證實(shí)PTC124能部分恢復(fù)HERG基因無義突變蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，驗(yàn)證了氨基糖苷類抗生素恢復(fù)HERG通道的結(jié)構(gòu)具有劑量依賴性的變化。為將來進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好基礎(chǔ)，也為無義突變所致心律失常的藥物治療帶來了新的希望。

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The Pharmaceutical Effects of PTC124 and G418 on Rescuing Nonsense Mutations of HERG GeneChannels

YU Hai-yun, YAO Yan, ZHANG Yin-hui, GONG Jing, HUANG Jian, PU Jie-lin.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Objective: To study the pharmaceutical effects of PTC124 and G418 at different doses on rescuing the nonsense mutation of HERG gene channels with its mechanism.

HERG; Nonsense mutation; PTC124; Inherited arrhythmia

2013-11-25)

（編輯：漆利萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81070150）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

于海云 博士研究生 主要從事心律失?；A(chǔ)研究 Email: yhy8702717@163.com 通訊作者：浦介麟 Email：jielinpu@yahoo.com

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1000-3614（2014）06-0461-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.06.017