王彬 史嘉偉 董念國(guó)

.基礎(chǔ)研究.

人主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程中Th17/Treg細(xì)胞比率的變化

王彬 史嘉偉 董念國(guó)

目的 研究Th17/Treg細(xì)胞是否參與主動(dòng)脈瓣膜鈣化及其與瓣膜鈣化發(fā)生相關(guān)的可能機(jī)制。方法 人主動(dòng)脈瓣膜組織分為3組(n=10):(1)對(duì)照組:瓣膜來(lái)自擴(kuò)張型心肌病需心臟移植的受體，排除瓣膜組織病理改變者；(2)纖維化組:瓣膜來(lái)自嚴(yán)重主動(dòng)脈瓣膜鈣化需瓣膜置換術(shù)者，取遠(yuǎn)離瓣膜鈣化部位，纖維化增生組織，排除風(fēng)濕熱及心內(nèi)膜炎病史者；(3)鈣化組:瓣膜來(lái)源同纖維化組，取瓣膜明顯鈣化組織。分別進(jìn)行von kossa染色、免疫組織化學(xué)分析，用于進(jìn)一步指導(dǎo)瓣膜組織分組；RT-PCR分析，檢測(cè)瓣膜組織內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果 對(duì)照組無(wú)Th17/Treg細(xì)胞浸潤(rùn)；纖維化組Th17細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于鈣化組(0.904±0.079比0.445±0.057，P＜0.01)；鈣化組Treg細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于纖維化組(0.900±0.058比0.396±0.032，P＜0.01)。結(jié)論 主動(dòng)脈瓣膜鈣化與纖維化組織中Th17/Treg細(xì)胞比率不同，調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞分化趨勢(shì)或許可以干預(yù)主動(dòng)脈瓣膜鈣化進(jìn)程。

主動(dòng)脈瓣膜鈣化； Th17細(xì)胞； Treg細(xì)胞

主動(dòng)脈瓣膜鈣化是老年人群中最常見(jiàn)的心臟瓣膜疾病，也是心血管疾病導(dǎo)致死亡的三大原因之一［1］。關(guān)于主動(dòng)脈瓣膜鈣化病理機(jī)制目前了解很少，還沒(méi)有藥物可以阻止或延緩瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展，主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)仍是嚴(yán)重瓣膜鈣化唯一有效的治療手段［2］。鈣化主動(dòng)脈瓣膜組織病理檢測(cè)，可見(jiàn)組織內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管及軟骨和骨組織形成，類(lèi)似于動(dòng)脈粥樣硬化慢性炎癥改變。Th17/Treg細(xì)胞參與了多種組織慢性炎癥的形成，本研究擬檢測(cè)Th17/Treg細(xì)胞是否參與主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循知情同意原則，搜集手術(shù)時(shí)切除的主動(dòng)脈瓣膜組織。骨橋蛋白(OPN)，α-平滑肌肌纖蛋白(α-SMA)，CD4，維甲酸孤兒受體-rt(retinoid orphan receptor-rt，RoRrt)和翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box protein-3，F(xiàn)OXP3)抗體購(gòu)自Bioworld公司；免疫組織化學(xué)試劑購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Trizol和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒和PCR反應(yīng)體系購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

主動(dòng)脈瓣膜分為3組(n=10):(1)對(duì)照組:瓣膜來(lái)自擴(kuò)張型心肌病需心臟移植的受體，排除瓣膜組織病理改變者；(2)纖維化組:瓣膜來(lái)自嚴(yán)重主動(dòng)脈瓣膜鈣化需瓣膜置換術(shù)者，排除風(fēng)濕熱及心內(nèi)膜炎病史者，取瓣膜明顯纖維性增生組織；(3)鈣化組:主動(dòng)脈瓣膜來(lái)源同纖維化組，取瓣膜明顯鈣化組織。

1.3 von Kossa染色

磷酸鹽緩沖液(PBS)將瓣葉漂洗2次，紫外線(xiàn)曝光下2%硝酸銀溶液浸泡20 min，雙蒸水洗滌5 min，5%亞硫酸鈉溶液浸泡2 min，水洗晾干，蘇木精復(fù)染2 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟至水，修復(fù)抗原，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加1∶150一抗液，于4℃濕盒中孵育過(guò)夜；PBS沖洗3次，滴加1∶100生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗3次，辣根酶標(biāo)記，室溫孵育30 min；PBS沖洗4次，DAB顯色；沖洗，蘇木精復(fù)染，封片，鏡檢拍照。

1.5 免疫組織熒光雙標(biāo)染色

實(shí)驗(yàn)方法基本同于免疫組織化學(xué)染色，相應(yīng)二抗需用熒光素標(biāo)記，若檢測(cè)第一種抗體選用的是紅色熒光，則第二種必須選擇其他顏色的熒光素標(biāo)記。NIKON Eclipse 80i熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)RoRrt和FOXP3基因表達(dá)

根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明提取組織內(nèi)總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。取5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增(表1)。各反應(yīng)體系均以β-actin作為內(nèi)參引物，最終產(chǎn)物5 μl行瓊脂糖凝膠電泳，軟件分析凝膠圖像目的基因灰度值。

表1 引物擴(kuò)增片段和退火溫度

反應(yīng)條件:50℃2 min；95℃10 min一個(gè)循環(huán)，95℃30 s；60℃30 s 30個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 von Kossa染色

對(duì)照組內(nèi)無(wú)鈣鹽沉積；纖維化組內(nèi)無(wú)鈣鹽沉積；鈣化組內(nèi)可見(jiàn)明顯鈣鹽沉積(圖1)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

OPN在對(duì)照組內(nèi)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，纖維化組內(nèi)有少量表達(dá)，鈣化組內(nèi)表達(dá)明顯；α-SMA在對(duì)照組及鈣化組內(nèi)可見(jiàn)少量表達(dá)，纖維化組內(nèi)表達(dá)明顯(圖2)。

2.3 免疫組織熒光雙標(biāo)染色

對(duì)照組內(nèi)無(wú)CD4++RoRrt+和CD4++FOXP3+細(xì)胞浸潤(rùn)；纖維化組內(nèi)CD4++RoRrt+細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，CD4++FOXP3+細(xì)胞浸潤(rùn)較少；鈣化組內(nèi)CD4++RoRrt+細(xì)胞浸潤(rùn)較少，CD4++FOXP3+細(xì)胞浸潤(rùn)明顯(圖3)。

圖1 組織von Kossa染色結(jié)果(×200):A，B:對(duì)照組、纖維化組內(nèi)未見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成；C:鈣化組內(nèi)可見(jiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)形成(箭頭所示)

圖2 組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200):A:對(duì)照組內(nèi)未見(jiàn)OPN表達(dá)，B:纖維化組可見(jiàn)OPN少量表達(dá)，C:鈣化組內(nèi)可見(jiàn)OPN明顯表達(dá)(箭頭所示)，D:對(duì)照組內(nèi)α-SMA少量表達(dá)(箭頭所示)，E:纖維化組內(nèi)α-SMA明顯表達(dá)，F(xiàn):鈣化組內(nèi)α-SMA可見(jiàn)表達(dá)

2.4 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

纖維化組和鈣化組均見(jiàn)RoRrt和FOXP3基因條帶，對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性條帶。Bandscan圖像處理軟件計(jì)算纖維化組和鈣化組目的基因與內(nèi)參條帶灰度比值，提示纖維化組內(nèi)RoRrt表達(dá)量明顯高于鈣化組(P＜0.01)，鈣化組內(nèi)FOXP3表達(dá)量明顯高于纖維化組(P＜0.01)(表2)。

表2 纖維化組與鈣化組內(nèi)目的基因與內(nèi)參灰度值比較(±s)

表2 纖維化組與鈣化組內(nèi)目的基因與內(nèi)參灰度值比較(±s)

注:與鈣化組比較，aP＜0.01

組別樣本數(shù)RoRrt/β-actin FOXP3/β-actin纖維化組10 0.904±0.079a0.396±0.032a鈣化組 10 0.445±0.057 0.900±0.058

3 討論

退行性主動(dòng)脈瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展是多因素引起的，最初被認(rèn)為是隨著年齡的增高，瓣膜老化、磨損導(dǎo)致鈣磷無(wú)機(jī)物被動(dòng)組織沉積引起的［3］。目前研究已經(jīng)證實(shí)，主動(dòng)脈瓣膜鈣化的形成類(lèi)似于動(dòng)脈粥樣硬化病理改變過(guò)程，是細(xì)胞及細(xì)胞分子相互作用，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞、增生，并向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，主動(dòng)發(fā)生的瓣膜組織異位鈣化過(guò)程［4］。

主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程中，局部組織內(nèi)持續(xù)存在的慢性炎癥對(duì)促進(jìn)瓣膜鈣化形成具有重要作用。Th17細(xì)胞在組織炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病形成中具有關(guān)鍵性作用。研究表明，Th17細(xì)胞最先浸潤(rùn)到組織受損部位，通過(guò)分泌白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-21等炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步趨化其他促炎細(xì)胞(中性白細(xì)胞，Th1細(xì)胞等)進(jìn)入病變組織，加劇局部組織炎癥反應(yīng)程度，已經(jīng)證實(shí)Th17細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化慢性炎癥形成中發(fā)揮了重要作用［5-6］。Treg細(xì)胞具有免疫抑制和抗炎功能，主要分泌抗炎因子IL-10、TGF-β1，它可全面抑制Th17細(xì)胞的活化、增生及生物活性，下調(diào)機(jī)體免疫反應(yīng)程度，避免過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷［7］。Th17細(xì)胞具有促炎、促免疫反應(yīng)發(fā)生作用，Treg細(xì)胞具有抗炎、抗免疫反應(yīng)功能，兩者自幼稚T細(xì)胞分化形成時(shí)來(lái)自共同的未分化前體細(xì)胞，分化成熟過(guò)程中還具有相互抑制現(xiàn)象［8］。關(guān)于Th17/Treg細(xì)胞在多種組織慢性炎癥疾病及免疫性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用已被大量報(bào)道［9］，是否在主動(dòng)脈瓣膜鈣化形成中也發(fā)揮作用，目前未見(jiàn)報(bào)道。

圖3 組織免疫組織熒光雙標(biāo)染色結(jié)果(×400):A:對(duì)照組未見(jiàn)CD4++RoRrt+細(xì)胞浸潤(rùn)，B:纖維化組明顯CD4++RoRrt+細(xì)胞浸潤(rùn)，C:鈣化組CD4++RoRrt+細(xì)胞少量浸潤(rùn)(箭頭所示)，D:對(duì)照組未見(jiàn)CD4++FOXP3+細(xì)胞浸潤(rùn)，E:纖維化組CD4++FOXP3+細(xì)胞少量浸潤(rùn)，F(xiàn):鈣化組CD4++FOXP3+細(xì)胞明顯浸潤(rùn)(箭頭所示)

正常主動(dòng)脈瓣膜主要由內(nèi)皮細(xì)胞、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。當(dāng)瓣膜組織受到損害性刺激時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞可活化、增生，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的活性增強(qiáng)。長(zhǎng)期反復(fù)的慢性炎癥刺激，可誘發(fā)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致瓣膜組織鈣化形成。本研究對(duì)照組來(lái)自擴(kuò)張型心肌病需心臟移植的患者，瓣膜組織內(nèi)無(wú)鈣磷沉積和OPN陽(yáng)性表達(dá)，少量表達(dá)α-SMA，可以認(rèn)為是正常主動(dòng)脈瓣膜組織。我們的結(jié)果表明，正常主動(dòng)脈瓣膜內(nèi)無(wú)Th17/Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。

主動(dòng)脈瓣膜在各種刺激因素作用下，由早期出現(xiàn)的纖維性增生到終末期組織內(nèi)異位鈣化形成是一個(gè)長(zhǎng)期的慢性炎癥改變過(guò)程。瓣膜組織內(nèi)鈣化形成，可以認(rèn)為是組織慢性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)局，是機(jī)體一種自我保護(hù)機(jī)制，同時(shí)也意味著局部炎癥反應(yīng)基本消失。我們的研究表明，纖維化組內(nèi)α-SMA表達(dá)最明顯，此時(shí)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞活化、增生程度最為劇烈，同時(shí)組織內(nèi)Th17細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，RoRrt基因表達(dá)量明顯高于鈣化組；鈣化組內(nèi)OPN明顯表達(dá)，表明瓣膜組織內(nèi)異位鈣化已經(jīng)形成，炎癥反應(yīng)趨于終結(jié)，同時(shí)組織內(nèi)Treg細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，F(xiàn)OXP3基因表達(dá)量明顯高于纖維化組。上述結(jié)果表明，在瓣膜組織發(fā)生纖維性增生時(shí)，組織內(nèi)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞Th17大量浸潤(rùn)，使局部炎癥反應(yīng)加劇并持續(xù)存在；瓣膜組織內(nèi)鈣化形成時(shí)，抑制炎癥反應(yīng)的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，促使局部炎癥反應(yīng)趨于消失。

瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是瓣膜鈣化發(fā)生的始發(fā)因素，瓣膜內(nèi)皮損傷及基底膜斷裂，脂質(zhì)及其他化合物的沉積，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)局部組織的慢性免疫炎癥反應(yīng)［10］。在炎癥反應(yīng)早期，Th17細(xì)胞大量浸潤(rùn)瓣膜組織內(nèi)。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，IL-17與其受體結(jié)合后可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、TNF、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶和趨化細(xì)胞因子等，這些炎癥介質(zhì)協(xié)同作用，可以進(jìn)一步趨化其他炎性細(xì)胞進(jìn)入組織受損部位，加劇組織炎癥損傷。有報(bào)道稱(chēng)，IL-17可以誘導(dǎo)各種促血管生成因子合成，促進(jìn)病變組織新生血管增多，有助于淋巴細(xì)胞局部組織浸潤(rùn)，更好地發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能［11］。當(dāng)瓣膜組織內(nèi)鈣化形成，慢性炎癥反應(yīng)趨于終結(jié)時(shí)，具有抑制免疫反應(yīng)和抗炎功能的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，Treg細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞接觸抑制或分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1發(fā)揮其生理功能。Treg細(xì)胞浸潤(rùn)增多，從而全面抑制Th17細(xì)胞的生物活性，下調(diào)機(jī)體免疫反應(yīng)程度，避免過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷?；赥h17/Treg細(xì)胞由共同未分化前體T細(xì)胞形成及他們生物活性相互拮抗的特點(diǎn)，大量基礎(chǔ)及臨床研究開(kāi)始探索通過(guò)調(diào)控兩者之間比率變化來(lái)治療各種炎癥性疾病和惡性腫瘤。

本研究首次證實(shí)了Th17/Treg細(xì)胞參與了主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程，Th17細(xì)胞可促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜鈣化過(guò)程中慢性炎癥形成，Treg細(xì)胞可全面拮抗Th17細(xì)胞的生物活性，使瓣膜組織內(nèi)炎癥反應(yīng)消失。因此，通過(guò)調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞分化趨勢(shì)，可以干預(yù)主動(dòng)脈瓣膜鈣化進(jìn)程。在瓣膜組織疾病演變過(guò)程中，組織內(nèi)浸潤(rùn)的Th17/Treg細(xì)胞比率也是不斷變化的。根據(jù)局部組織內(nèi)微環(huán)境信號(hào)的不同，Th17/Treg細(xì)胞可互相調(diào)控，兩者比率發(fā)生微妙變化，從而控制局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生或消失。

總之，主動(dòng)脈瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展是多因素引起的，雖然大量的臨床與基礎(chǔ)研究從各個(gè)方面試圖去解釋其形成的病理生理機(jī)制，但目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制還了解很少。Th17/Treg細(xì)胞參與了主動(dòng)脈瓣膜鈣化形成，可能在瓣膜組織慢性炎癥的形成與消亡中發(fā)揮了一定作用，明白它們之間在主動(dòng)脈瓣膜鈣化發(fā)展過(guò)程中的微妙變化，可以為我們探索主動(dòng)脈瓣膜鈣化形成的病理生理機(jī)制打開(kāi)新的思路。

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Change of Th17/Treg cells ratio in the process of aortic valve calcification

Wang Bin，Shi Jiawei，Dong Nianguo.
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To study whether Th17/Treg cell taking part in the development of aortic valve(AV)calcification.M ethods The tissue of AV was divided into three groups(n=10):control group，fibrous degeneration group and calcification group.Valve tissue in control group was taken from patients being subject to heart transplantation because of dilated cardiomyopathy，excluding valves with pathological change.Valve tissue in fibrous degeneration group was taken from location being away from calcification change，only fibrous thickening in patients being subject to valve replacement because of severe AV calcification，and excluding patients with rheumatism and endocarditis.Valve source in calcification group was the same of fibrous degeneration group，but taken from location being obvious calcification.Every sample was tested by von kossa stain or immunohistochemistry analysis and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results Th17/Treg cells were not present in control group.In fibrous degeneration group，the level of Th17 cell infiltration was significantly higher than that of calcification group (0.904±0.079 vs.0.445±0.057，P＜0.01).The level of Treg cell infiltration in calcification group was significantly higher than in fibrous degeneration group(0.900±0.058 vs.0.396±0.032，P＜0.01).Conclusions The ratio of Th17/Treg cells is different in aortic valve calcification and fibrosis tissue.By controlling the tendency of Th17/Treg cells differentiation may interfere the progression of AV calcification.

Aortic valve calcification； Th17 cell； Treg cell

Dong Nianguo，Email:Dongnianguo@hotmail.com

2014-02-15)

(本文編輯:周白瑜)

This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China(No.87210297)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.04.010

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(87210297)

430022武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科

董念國(guó)，電子信箱:Dongnianguo@hotmail.com