戴夢源，陳 晨(綜述)，陶澤璋(審校)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060)

近年來，干細(xì)胞的研究加深了人們對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)，很多腫瘤的發(fā)生都與干細(xì)胞相關(guān)。干細(xì)胞標(biāo)志物成為目前研究的熱點(diǎn)，研究證實(shí)Lgr5在人體小腸底部隱窩基底柱狀細(xì)胞、結(jié)腸隱窩、胃腺體底部及毛囊中均有不同程度的表達(dá),其可作為多種人體組織干細(xì)胞的標(biāo)志物。此外，研究證明Lgr5與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1]。

1 Lgr5的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Lgr5,即富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5)，又名GPR49、HG38、FEX、GPR67和MGC117008，是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一[1]。Lgr5多肽鏈的外功能區(qū)有17個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列，N端和C端尾部側(cè)翼富含半胱氨酸序列以及高度保守的7次α螺旋跨膜區(qū)[2]。

Lgr5廣泛分布于人體組織中，在大腦、脊髓、毛囊、乳腺、眼睛、胃腸道及生殖器官等均有表達(dá)[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)家族蛋白R(shí)-spondins(RSPOs)為孤受體Lgr4、Lgr5的生理性配體，結(jié)合后可強(qiáng)化Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育和成體干細(xì)胞自我更新及維持中起著重要作用[3]。研究表明，Lgr5是多種組織成體干細(xì)胞的標(biāo)志物，并與腫瘤的形成密切相關(guān)[4]。

2 Lgr5是成體干細(xì)胞的新標(biāo)志物

2.1Lgr5作為小腸干細(xì)胞標(biāo)志物 小腸干細(xì)胞通過隱窩分裂的方式來實(shí)現(xiàn)增殖。Gregorieff等[5]的研究表明，鼠類小腸不斷自我更新的上皮組成了隱窩及小腸絨毛。腸隱窩是單克隆的，每一隱窩都起源于各自的腸干細(xì)胞。干細(xì)胞通過不對(duì)稱分裂有規(guī)律地產(chǎn)生短暫增殖細(xì)胞，從而分化為各個(gè)類型的小腸上皮細(xì)胞。在過去十年中，許多小腸干細(xì)胞標(biāo)志物被相繼提出，Lgr5是最新研究的小腸干細(xì)胞標(biāo)志物[6]。

Wnt信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)成人腸道上皮細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)鍵作用。Barker等[7]設(shè)想一些Wnt/β聯(lián)蛋白的目標(biāo)基因也許特異性的表達(dá)于干細(xì)胞上，研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在小腸隱窩基底柱狀細(xì)胞(crypt base columnar cell，CBC)過度表達(dá)，體外培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Lgr5+CBC能形成人類所有類型的腸上皮細(xì)胞，表明Lgr5可能是小腸干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志物。Yui等[8]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞來源的類器官移植物可在小鼠體內(nèi)形成功能和組織學(xué)正常的自我更新的隱窩，并觀察到移植物在體外大量擴(kuò)增。Lgr5+CBC具有自我更新特性，是小腸的干細(xì)胞[9]。

小腸隱窩基底切片顯示，Lgr5+CBC和終末分化的旁氏細(xì)胞有顯著的對(duì)稱性[5]。形態(tài)學(xué)上，Lgr5+CBC的特點(diǎn)是稀少的細(xì)胞質(zhì)和楔形的核，均朝向隱窩腔，很容易與毗鄰的旁氏細(xì)胞相區(qū)別[10]。Sato等[11]研究發(fā)現(xiàn)，旁氏細(xì)胞表達(dá)表皮生長因子、腫瘤壞死因子α、Wnt3以及Notch配體CD114等干細(xì)胞生長所必需的信號(hào)。干細(xì)胞和旁氏細(xì)胞共同培養(yǎng)顯著地促進(jìn)了結(jié)腸類器官的形成。在體內(nèi)，隨著旁氏細(xì)胞的凋亡，Lgr5+干細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了大幅度降低。目前研究發(fā)現(xiàn)，在小腸上皮中旁氏細(xì)胞是Lgr5+干細(xì)胞壁龕的關(guān)鍵組成部分[11]。

2.2Lgr5+細(xì)胞與結(jié)腸干細(xì)胞 結(jié)腸干細(xì)胞位于結(jié)腸黏膜的隱窩基底部，其功能為維持結(jié)腸黏膜上皮的正常再生。以往的研究表明，CD133是結(jié)腸干細(xì)胞的標(biāo)志物[12]。Barker等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5+細(xì)胞局限性表達(dá)于結(jié)腸隱窩底部，可自我更新并分化成為黏膜所有的細(xì)胞類型。通過長期跟蹤觀察LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，上皮所有細(xì)胞類型均表達(dá)在Lgr5+細(xì)胞組成的綠色克隆區(qū)，這一區(qū)域的細(xì)胞具有多潛能性，由此推測Lgr5+細(xì)胞代表了結(jié)腸上皮的永久干細(xì)胞；此實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記的結(jié)腸隱窩干細(xì)胞幾乎都局限性表達(dá)于基底部，由此推測小腸干細(xì)胞比結(jié)腸干細(xì)胞活躍[13]。

2.3Lgr5+細(xì)胞與毛囊干細(xì)胞 基因微陣列分析顯示，Lgr5 mRNA高度表達(dá)于毛囊上段的隆突區(qū)，即皮脂腺開口處和立毛肌附著處的毛囊外根鞘，與毛囊生長密切相關(guān)[14]。Vander Flier等[15]發(fā)現(xiàn)，從毛囊隆突區(qū)分離得到的表達(dá)Lgr5的細(xì)胞是一種活躍增殖并且具有多分化潛能的干細(xì)胞群，可在移植后形成毛囊、皮脂腺和表皮。Barker等[7]通過譜系追蹤試驗(yàn)也證實(shí)了Lgr5+細(xì)胞代表了毛囊的長期干細(xì)胞，在毛發(fā)周期過程中對(duì)毛發(fā)的循環(huán)再生起著重要的作用。Lgr5是周期性、長期存在的毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物。

2.4Lgr5+細(xì)胞與胃干細(xì)胞 胃干細(xì)胞主要位于峽部及腺體基部與上皮表面之間，但是目前還未發(fā)現(xiàn)明確的干細(xì)胞標(biāo)志物。Gregorieff等[5]在幽門腺體基底部發(fā)現(xiàn)了可自我更新并多向分化的增殖Lgr5+細(xì)胞，譜系追蹤表明整個(gè)腺體來源于Lgr5+細(xì)胞。

2.5Lgr5+細(xì)胞與乳腺干細(xì)胞 目前還未發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞確切的標(biāo)志物。Ginestier等[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺干細(xì)胞定位于末端導(dǎo)管小葉單位；Sleeman等[17]的研究則顯示干細(xì)胞位于基底上皮層；Gregorieff等[5]的研究發(fā)現(xiàn)Lgr5表達(dá)于乳腺基底上皮層。Lgr5能否作為乳腺干細(xì)胞標(biāo)志物還需進(jìn)一步研究來證實(shí)。

小腸、結(jié)腸和胃起源于內(nèi)胚層，皮膚、乳腺起源于外胚層，由此可見Lgr5是橫跨胚層的干細(xì)胞標(biāo)志物，也許能代表成體干細(xì)胞的普遍標(biāo)志物。

3 Lgr5在腫瘤組織中的表達(dá)

目前研究發(fā)現(xiàn),Lgr5在正常人體組織中的表達(dá)呈局限性,而在胃腸道、卵巢、肝臟及基底細(xì)胞癌等腫瘤組織中,Lgr5的表達(dá)均有不同程度的升高[5]。

3.1Lgr5在胃腸道腫瘤中的表達(dá) Becker等[18]采用免疫染色法比較胃腸道正常組織和癌前病變組織發(fā)現(xiàn)，在癌前病變組織中Lgr5的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且在正常胃腸組織中Lgr5的表達(dá)局限于隱窩基底部，而在癌前病變組織中Lgr5表達(dá)并不僅局限于隱窩基底部。由此可知，Lgr5離開隱窩基底部是腫瘤形成和惡化的早期事件，Lgr5對(duì)腫瘤的發(fā)生可能有重要作用。與之相似，結(jié)腸腫瘤的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,Lgr5在正常結(jié)腸組織中呈陰性或弱陽性表達(dá)，而在結(jié)腸腫瘤中則呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá),高水平的Lgr5表達(dá)可能與胃腸道腫瘤的形成密切相關(guān)[19]。

3.2Lgr5在肝癌中的表達(dá) Lgr5在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Yamamoto等[19]通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Lgr5 mRNA在HCC組織中的表達(dá)顯著高于非肝癌組織，在含有β聯(lián)蛋白外顯子3突變的HCC中，Lgr5基因過表達(dá)率達(dá)到了87.5%；把突變的β聯(lián)蛋白導(dǎo)入小鼠肝細(xì)胞中也可引起小鼠Lgr5表達(dá)上調(diào)。由此推測，在肝癌中Lgr5很可能是被Wnt信號(hào)途徑激活的目標(biāo)基因，Lgr5可能與肝癌的形成和發(fā)展有一定聯(lián)系。

3.3Lgr5在基底細(xì)胞癌中的表達(dá) Tanese等[20]采用DNA微陣列分析人類基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)病例，發(fā)現(xiàn)Lgr5在所有基底細(xì)胞癌病例中的表達(dá)均顯著上調(diào)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，BCC病例中Lgr5 mRNA表達(dá)上調(diào)率為95%(19/20)；敲除小鼠BCC細(xì)胞株的Lgr5基因，則可顯著抑制BCC細(xì)胞的增殖。人類永生角質(zhì)HaCaT細(xì)胞中Lgr5過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，而把Lgr5過表達(dá)的HaCaT細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠則可誘發(fā)腫瘤形成。Lgr5基因可導(dǎo)致細(xì)胞的快速增殖，與腫瘤組織的形成有著十分緊密的聯(lián)系。

3.4Lgr5在食管病變中的表達(dá) Becker等[7]對(duì)食管樣本的研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5在Barrett食管中表達(dá)率增加(70%)，在高級(jí)不典型增生和食管腺癌中的表達(dá)率幾乎達(dá)到100%。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Lgr5的高表達(dá)率與食管腺癌不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān),提示Lgr5有作為Barrett食管、不典型增生和食管腺癌生物學(xué)標(biāo)記的潛能，是癌前病變及腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

3.5Lgr5在其他腫瘤中的表達(dá) Nakata等[21]研究表明，腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中Lgr5轉(zhuǎn)錄水平增高，其利用免疫熒光染色確定了CD133-和Lgr5+細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的共同定位。在功能上，由慢病毒介導(dǎo)的Lgr5基因敲除誘導(dǎo)了腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤成體干細(xì)胞的凋亡。Lgr5的消耗還導(dǎo)致了L1細(xì)胞黏附分子的表達(dá)下調(diào)。此外，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生中，Lgr5的表達(dá)增加與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。

Swetlana等[22]檢測77例軟組織肉瘤患者組織切片中野生型Lgr5和GPR49Δ5(缺少外顯子5的Lgr5剪接變異體)的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)GPR49Δ5mRNA低表達(dá)與軟組織肉瘤的不良預(yù)后和短期無復(fù)生存率顯著相關(guān)，同時(shí)，GPR49Δ5mRNA低表達(dá)的患者比高表達(dá)的患者平均發(fā)病年齡晚7.5年，顯示了GPR49Δ5表達(dá)在軟組織肉瘤的發(fā)生和進(jìn)展中的作用。

4 小結(jié)與展望

Lgr5廣泛分布于多種人體組織，在多種腫瘤中表達(dá)增加，提示它有著重要的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用前景。目前，關(guān)于Lgr5在不同信號(hào)途徑中發(fā)揮作用的機(jī)制以及Lgr5細(xì)胞是否代表了腫瘤干細(xì)胞等問題，還有待進(jìn)一步的研究來證實(shí)。因Lgr5在腫瘤發(fā)生中的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。對(duì)Lgr5的研究提升了對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)的理解，對(duì)鑒定和分離成體干細(xì)胞群、開發(fā)其臨床藥用潛能也有著很大作用。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，有望在未來能利用這些潛在的人類干細(xì)胞群為胃腸、皮膚等疾病的治療提供新的手段。

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