王 芳

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 保定071000)

妊娠期高血壓是產(chǎn)科常見疾患，占全部妊娠的5%～10%，所造成的孕產(chǎn)婦死亡約占妊娠相關(guān)死亡總數(shù)的10%～16%，是孕產(chǎn)婦死亡的第二大原因。其主要癥狀有高血壓、蛋白尿、水腫等[1]。妊娠期高血壓的發(fā)病機制尚不確定，目前文獻(xiàn)研究報告其機制可能是胎盤缺血缺氧，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷造成的血壓升高[2]。該學(xué)說認(rèn)為妊娠期高血壓疾病分為兩步，首先以滋養(yǎng)細(xì)胞侵入過淺為特點，導(dǎo)致胎盤淺著床[3]，此階段無臨床表現(xiàn)；第二階段胎盤缺血缺氧，釋放的可溶性因子進入母體循環(huán)，引起內(nèi)皮系統(tǒng)功能受損而出現(xiàn)血壓升高和蛋白尿等癥狀。本研究欲通過酶聯(lián)免疫吸附實驗、免疫組織化學(xué)法分別探討妊娠期高血壓患者和正常孕婦的血清可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體(sFlt-1)和胎盤可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體(Flt-1)蛋白的差異，尋找其內(nèi)在聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年1月至2010年1月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科待產(chǎn)的產(chǎn)婦，排除與妊娠高血壓有相關(guān)性并發(fā)癥，如原發(fā)性高血壓、慢性肝炎、貧血、胎兒生長遲緩等。按是否發(fā)生妊娠期高血壓分為妊娠期高血壓組(妊娠高血壓組)40例，年齡24～32(26.1±3.2)歲，孕周未發(fā)生妊娠期高血壓組(無妊娠高血壓組)20例為無妊娠高血壓組，年齡24～32(27.4±2.8)歲，孕周34.2～42.4(38.4±2.7)周。妊娠高血壓組中按是否發(fā)生突然暈厥、四肢抽搐分為輕度子癇前期組18例，年齡25～31(28.6±2.0)歲，孕周35.1～42.4(37.7±1.8)周；重度子癇前期組22例，年齡24～32(37.7±1.8)歲，孕周37.2～41.7(39.3±1.9)周。年齡、孕周在輕度子癇前期組和重度子癇前期組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，妊娠高血壓組和無妊娠高血壓組之間存在可比性。

1.2方法

1.2.1實驗儀器和試劑 采用由上海藍(lán)基生物有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測血清sFlt-1，上海億欣生物公司生產(chǎn)的Flt-1兔抗人單克隆抗體檢測胎盤Flt-1。在南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司生產(chǎn)的DG5033A 酶聯(lián)免疫檢測儀下檢測結(jié)果。

1.2.2實驗方法 血清sFlt-1水平的測定采用酶聯(lián)免疫吸附實驗法:在條板中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品室溫孵育2 h后震動吸凈殘留物，每孔加入200 μL sFlt-1酶結(jié)合物再孵育2 h，震動吸凈，再孵育30 min，加入50 μL終止液，5 min內(nèi)酶標(biāo)儀OD450(波長450 nm時的吸光度)進行吸光度定量測定。

胎盤Flt-1蛋白表達(dá)水平的測定采用免疫組織化學(xué)法?；瘜W(xué)處理消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，用高壓鍋法冒氣2 min后滴加封閉液，室溫孵育10～15 min不洗片；滴加一抗兔抗人Flt-1(效價1∶50)，置于濕盒中4 ℃冰箱過夜，改良磷酸鹽緩沖液振洗3次，每次5 min；滴加二抗PV6001葡聚糖-酶復(fù)合物，37 ℃孵育60 min；改良磷酸鹽緩沖液振洗3次，每次5 min；滴加過氧化物酶顯色劑：改良磷酸鹽緩沖液4 mL，過氧化物酶5 g，H2O 25 μL，顯色10 min左右；蒸餾水充分沖洗5次；蘇木精復(fù)染1 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片；光鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3胎盤組織Flt-1染色方法 從胎盤母體面中央(避開明顯纖維化、鈣化區(qū))切取胎盤組織1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，充分漂洗，置10%甲醛溶液中固定24 h以上，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度2 μm，蘇木精-伊紅染色觀察胎盤組織學(xué)特征，再進行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4胎盤組織Flt-1免疫組織化學(xué)染色評分 以細(xì)胞胞質(zhì)有棕褐色顆粒沉著為陽性細(xì)胞，計數(shù)每個視野所含細(xì)胞數(shù)，計數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù)及著色強度。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及著色強度綜合制訂免疫組織化學(xué)半定量記分標(biāo)準(zhǔn)：①陽性細(xì)胞記分-無陽性細(xì)胞為0分；<25%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。②著色強度記分-細(xì)胞內(nèi)無染色或染色與背景一致為0分；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見少量淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多深棕色顆粒為2分；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量深棕色或褐色顆粒為3分。陽性細(xì)胞計分和著色強度計分相加為最終判定結(jié)果：0～1分(陰性)，1～3分(弱陽性)，3～5分(陽性)，5～6分強陽性。

2 結(jié) 果

2.1sFlt-1的檢測結(jié)果 妊娠高血壓組sFlt-1值為(9012.74±3892.12) ng/L顯著高于無妊娠高血壓組的(2012.46±401.23) ng/L，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.86,P<0.05)。且輕度子癇20例sFlt-1為(5832.53±417.34) ng/L，重度子癇20例sFlt-1為(1243.15±278.37) ng/L，輕度子癇者的sFlt-1顯著高于重度子癇者(t=59.00,P<0.01)。

2.2胎盤組織Flt-1的檢測結(jié)果 妊娠高血壓組的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)增生，有血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其中滋養(yǎng)細(xì)胞增厚，基質(zhì)出現(xiàn)纖維化，絨毛毛細(xì)血管內(nèi)膜增厚，宮腔不暢，血管內(nèi)皮損傷，出現(xiàn)紅細(xì)胞，而無妊娠高血壓組基本均表現(xiàn)正常(見表1)。

表1 無妊娠高血壓組與妊娠高血壓組胎盤組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果

2.3胎盤組織中Flt-1蛋白表達(dá)強度(免疫組化染色評分)比較 在妊娠高血壓組中，輕度子癇組蛋白表達(dá)強度均值為(1.5±0.5)分，重度子癇組均值為(1.2±0.3)分，兩組數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.35，P<0.05)隨著病情的加重，胎盤組織中Flt-1蛋白表達(dá)強度依次下降，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=8.67，P<0.05)(表2)。

表2 無妊娠高血壓組和妊娠高血壓組胎盤組織中Flt-1蛋白表達(dá)強度比較

3 討 論

本研究結(jié)果與其他學(xué)者報道的研究結(jié)果基本一致[4]。關(guān)于Flt-1對妊娠高血壓的發(fā)病機制，可能涉及母體、胎盤和胎兒等多種因素，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、免疫調(diào)節(jié)功能異常、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、遺傳因素和營養(yǎng)因素[5]；血管痙攣、內(nèi)皮細(xì)胞激活、升壓反應(yīng)增加、前列腺素、一氧化氮、內(nèi)皮素和血管生成和抗血管生成的蛋白質(zhì)等。但是沒有任何一種單一因素能夠解釋所有子癇前期發(fā)病的病因和機制。相關(guān)研究鏡下觀察結(jié)果表明滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足[6]，胎盤小動脈數(shù)量減少、深度過淺導(dǎo)致胎盤絨毛缺血缺氧[7-8]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而釋放大量活性細(xì)胞因子，進一步加劇妊娠高血壓的發(fā)生。

另有研究表明，妊娠高血壓是一種多因素多基因引發(fā)的疾病，有家族遺傳傾向?；甲影B前期的母親其女兒子癇前期發(fā)病率為20%～40%；患子癇前期的婦女其姐妹子癇前期發(fā)病率為11%～37%；雙胞胎中患子癇前期的婦女其姐妹子癇前期發(fā)病率為22%～47%[9-10]。但至今為止，其遺傳模式尚不清楚。故在有妊娠高血壓家族史的產(chǎn)婦中應(yīng)特別關(guān)注子癇的發(fā)生。

本研究顯示，血清sFlt-1、胎盤組織Flt-1參與了上述病理生理過程。本試驗表明，血清sFlt-1和胎盤組織Flt-1蛋白可能對妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展起到一定的促進作用。對孕婦檢測有助于妊娠高血壓的早期診斷。

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