張若云, 徐廣銳, 潘 聰, 謝莉萍, 王洪鐘, 張貴友, 張榮慶

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084)

合浦珠母貝iPS細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分析

張若云, 徐廣銳, 潘 聰, 謝莉萍, 王洪鐘, 張貴友, 張榮慶

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084)

轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS細(xì)胞研究中具有重要作用, 將它們加入體外培養(yǎng)的細(xì)胞中, 可以誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化成為多能干細(xì)胞。作者通過(guò) RACE-PCR技術(shù)從合浦珠母貝(Pinctada fucata)的外套膜組織中克隆獲得了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全長(zhǎng)1585bp,開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為1131bp, 編碼376個(gè)氨基酸, 蛋白結(jié)構(gòu)分析表明它具有保守的HLH和Myc-N結(jié)構(gòu)域。Sox2全長(zhǎng) 1908bp, 開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為 990bp, 編碼329個(gè)氨基酸, 蛋白結(jié)構(gòu)分析它具有保守的HMG-box和Soxp結(jié)構(gòu)域。KLF4全長(zhǎng)2268bp, 開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)624bp, 編碼207個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)該蛋白具有兩個(gè)zf-H2C2_2結(jié)構(gòu)域。BLAST分析它們均與太平洋牡蠣的相關(guān)蛋白具有較高同源性, 說(shuō)明其與太平洋牡蠣親緣關(guān)系更近。RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因在合浦珠母貝外套膜、足、生殖腺、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和鰓 6種組織中均有表達(dá), 表明它們是非常保守的轉(zhuǎn)錄因子。本研究對(duì)于合浦珠母貝細(xì)胞系建立和研究具有啟發(fā)意義。

誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞; 轉(zhuǎn)錄因子; 克隆; 合浦珠母貝(Pinctada fucata)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)具有高度的分化潛能, 可以分化為機(jī)體所有類型的細(xì)胞,在細(xì)胞治療、組織器官移植等臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的潛在用途[1]。誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)具有與ESC相似的高度分化潛能, 由于它是由成體細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化而來(lái), 因此,不僅規(guī)避了使用人類胚胎的倫理爭(zhēng)議, 也可以使用病人自體細(xì)胞, 設(shè)計(jì)更加個(gè)性化的治療方案。

自從日本學(xué)者 Yamanaka領(lǐng)導(dǎo)的課題組先后將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4導(dǎo)入體外培養(yǎng)的小鼠和人的成纖維細(xì)胞, 使其去分化, 并轉(zhuǎn)化為iPS 細(xì)胞[1-2]后, iPS細(xì)胞在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。

由于這些轉(zhuǎn)錄因子參與維持干細(xì)胞的多能性和自我更新的能力, 故而又被稱作多能性因子(Pluripotency factors)。多能性因子通常具有3個(gè)特點(diǎn): (1)通常在胚胎發(fā)育早期表達(dá)量較高, 而在大多數(shù)已分化的組織中表達(dá)降低; (2)維持干細(xì)胞的多能性, 其表達(dá)量過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起胚胎干細(xì)胞分化; (3)多能性因子可協(xié)同作用[3]。

這4種多能因子在iPS細(xì)胞中起著至關(guān)重要但各不相同的作用。

Oct4在干細(xì)胞、早期胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞中特異表達(dá), 且主要通過(guò)與其他重要的轉(zhuǎn)錄因子, 如Sox2和Nanog等, 協(xié)同作用調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多能性[4-5]。c-Myc基因的表達(dá)與細(xì)胞的增殖分化有關(guān), 例如,c-Myc基因的表達(dá)量增強(qiáng)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)惡變,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生, 而在細(xì)胞分化的過(guò)程中,c-Myc基因的表達(dá)量則會(huì)降低[5-6]。Sox2基因在胚胎早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用, 可以作為多能性細(xì)胞譜系的一個(gè)標(biāo)志物[5]。在體外,Sox2在未分化的胚胎干細(xì)胞(ES cell)、胚胎癌細(xì)胞(EC cell)中表達(dá), 且隨著細(xì)胞的分化, 其表達(dá)量降低[7-9]。KLF4同樣也在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 可以通過(guò)作用于靶基因p21異位表達(dá), 從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖, 也可在p21缺失的細(xì)胞中, 通過(guò)下調(diào)p53來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。

本實(shí)驗(yàn)室之前的研究證明合浦珠母貝外套膜組織在體外培養(yǎng)時(shí)功能與體內(nèi)外套膜細(xì)胞類似, 由此為在細(xì)胞水平上研究珍珠質(zhì)生物礦化提供了新方法[10]。但是合浦珠母貝外套膜細(xì)胞體外增殖和傳代培養(yǎng)一直是體外細(xì)胞系建立與培養(yǎng)的難題[11-13]。此次克隆得到合浦珠母貝中的轉(zhuǎn)錄能因子Sox2、KLF4及c-Myc基因,一方面為合浦珠母貝中 iPS細(xì)胞研究奠定基石; 另一方面考慮到這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中所起的重要作用, 或許也可以為合浦珠母貝建立細(xì)胞系提供支持, 為生物礦化研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

合浦珠母貝(Pinctada fucata)采自廣西北海市珍珠總公司珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)。5′/3′RACE Kit(Clotech公司),EasyPureQuick Gel Extraction Kit(TransGen公司), dNTPs、Reverse Transcriptase M-mLV、各種酶(TaKaRa公司), Trizol 試劑(Invitrogen), DEPC(上海生工), 及IPTG、X-gal(Sigma); 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純, 各種引物由上海生工合成, DNA測(cè)序由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的合浦珠母貝外套膜轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中c-Myc、Sox2及KLF4基因的同源序列片段設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE引物, 基因克隆所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA克隆所需引物Tab.1 The primers for cloning cDNA of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

在得到c-Myc、Sox2及KLF4基因5′和3′端序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)Full1和Full2兩端引物。

RT-PCR所需引物見(jiàn)表2。

1.2.2 總RNA提取

取合浦珠母貝的外套膜組織, 用液氮迅速冷凍后磨碎, 加適量Trizol 試劑(50～100 mg/mL )。總RNA提取步驟如下: 樣本中加入200 μL氯仿, 混勻后室溫放置3 min, 離心15 min取上清; 重復(fù)上述步驟一次;上清加入 500 μL 異丙醇, 混勻靜置 10 min, 離心15 min棄上清; 加入 1mL 75%乙醇, 振蕩混勻離心5 min; 沉淀室溫晾干, 加入40 μL DEPC水溶解, –80℃保存。通過(guò)A260/280檢驗(yàn)獲得的RNA的完整性和濃度。

表2 RT-PCR和Real-Time PCR所需引物Tab.2 The primers for RT-PCR and Real-Time PCR

1.2.3 基因的克隆

5′RACE和 3′RACE按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒進(jìn)行: 首先以合浦珠母貝外套膜的總 RNA為模板, 合成 5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE- Ready cDNA。然后分別以這兩個(gè) cDNA序列為模板, 進(jìn)行 5′RACE和3′RACE。PCR反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

根據(jù)得到的 5′端和 3′端的兩段序列進(jìn)行全長(zhǎng)基因的PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸3 min, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳, 切下目的條帶, 回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與T/A克隆載體pGEM-T easy vector (Promega)連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans2-Blue Chemically Competent Cell (TransGen)菌株, 通過(guò)菌落PCR選取陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

1.2.4 基因的序列分析

應(yīng)用ORF Finder查找開(kāi)放閱讀框; 用ProtParam (http: //web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn); 應(yīng)用 SignalP(http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽; 并且使用 Pfam(http:// pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用blast在線工具(http: //web.expasy.org/blast/)比對(duì)核苷酸和氨基酸序列的同源性, 使用 MEGA4軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 基因的組織分布

首先采用 TaKaRa公司的 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒, 按照說(shuō)明書(shū)條件操作, 將合浦珠母貝外套膜、足、生殖腺、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和鰓6種組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。然后通過(guò)RT-PCR鑒定目的基因在各組織分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 c-Myc、Sox2及KLF4基因的克隆及其序列分析

通過(guò)RACE方法克隆獲得c-Myc、Sox2及KLF4基因的全長(zhǎng)cDNA, genbank登錄號(hào)分別為KC758857、KC758858和KC758859。

基因c-Myc、Sox2及KLF4的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等信息如表3及圖1～圖3所示。

2.2 編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

表3 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA序列及其編碼的蛋白性質(zhì)Tab.3 Sequences and proteins of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

圖1 c-Myc基因全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列Fig.1 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of c-Myc gene from Pinctada fucata

通過(guò)SignalP、Pfam和SOPMA在線分析得到以下結(jié)果。

c-Myc蛋白沒(méi)有信號(hào)肽, 不存在跨膜區(qū)。Pfam軟件預(yù)測(cè)該編碼蛋白含有一段保守的 HLH(helixloop-lelix domain)結(jié)構(gòu)域, 及 Myc-N 保守區(qū)域, 而myc蛋白家族是典型的HLH亮氨酸拉鏈型轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)與DNA特異位點(diǎn)結(jié)合而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控, 從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。據(jù)此分析, 該編碼蛋白預(yù)測(cè)正確并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14-15]。

Sox2蛋白未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽, Pfam 預(yù)測(cè)含有HMG-box(high mobility group box), 它是Sox蛋白的特征保守結(jié)構(gòu)域, 這種高遷移率基團(tuán)在需要染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變的 DNA相關(guān)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮作用,如復(fù)制轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)等[10,13]。編碼蛋白上還含有一段與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的Soxp(Sox transcription factor)結(jié)構(gòu)域[16]。推測(cè)該編碼蛋白參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖2 Sox2基因全長(zhǎng)cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.2 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of Sox2 gene from Pinctada fucata

KLF4蛋白未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽, Pfam預(yù)測(cè)含有兩個(gè)zf-H2C2_2(Zinc-finger double domain )結(jié)構(gòu)域, 這是KLF蛋白的特征結(jié)構(gòu)域, 表明編碼蛋白與基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)[17-18]。

2.3 c-Myc、Sox2及 KLF4蛋白的同源性分析

利用BLAST軟件分析c-Myc、Sox2及KLF4基因編碼蛋白的同源性, 并使用 MEGA4軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。

同源性分析結(jié)果顯示: (1)c-Myc基因編碼蛋白與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的Myc蛋白同源性最高, 約為 63%。同時(shí), 編碼蛋白與弗羅里達(dá)文昌魚(yú)(Branchiostoma floridae)、青島文昌魚(yú)(Branchiostomabelcheri)以及半索動(dòng)物長(zhǎng)吻蟲(chóng)(Saccoglossus kowalevskii)的Myc蛋白也分別有約45%、45%和47%的相似性。(2)在分類學(xué)上, 合浦珠母貝與太平洋牡蠣同為軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia), 文昌魚(yú)與長(zhǎng)吻蟲(chóng)同屬脊索動(dòng)物門(mén)(Chordata)。在c-Myc基因的保守性上, 合浦珠母貝與太平洋牡蠣保同源性更高,而與文昌魚(yú)和柱頭蟲(chóng)的同源性較低。(3)Sox2基因編碼蛋白與太平洋牡蠣(C. gigas) 、池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii) 的 Sox2蛋白以及歐洲冒貝(Patella vulgata) 的uSoxB蛋白分別有約67%、68%和72%的相似性。池蝶蚌也屬雙殼綱, 冒貝屬腹足綱(Gastropoda)。這3種生物與合浦珠母貝親緣關(guān)系都比較近,同源性比對(duì)結(jié)果也相近。(4)KLF4基因編碼蛋白與紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的 KLF4蛋白、長(zhǎng)吻蟲(chóng)(S. kowalevskii)的類KLF2轉(zhuǎn)錄因子和擬正海膽(Paracentrotus lividus)的KLF2/4蛋白分別有約 96%、96%和 95%的相似性, 另外與太平洋牡蠣C. gigas的KLF1蛋白同源性約為67%。(5)擬正海膽屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata), 編碼KLF4蛋白與海膽中同一亞型蛋白同源性更高, 96%的同源性表明KLF4基因在不同物種中具有高度的保守型。與牡蠣中KLF1蛋白的同源性較低, 可能是由于這兩個(gè)蛋白亞型自身的差異所致。(6)同源性比對(duì)結(jié)果顯示合浦珠母貝中的這 3個(gè)基因與太平洋牡蠣同源性最高,事實(shí)上牡蠣與珍珠貝同是雙殼貝類, 親緣關(guān)系本來(lái)就相近, 這里也得到證明。(7)而 3個(gè)基因的同源性比對(duì)數(shù)據(jù)顯示, KLF4蛋白在不同物種中的同源性最高, 表明KLF4基因在不同物種中更為保守,Sox2的保守性次之,c-Myc基因相對(duì)最不保守。

圖3 KLF4基因全長(zhǎng)cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.3 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of KLF4 gene from Pinctada fucata

圖4 c-Myc(a)、Sox2(b)和KLF4(c)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of c-Myc (a), Sox2 (b) and KLF4 (c) gene

2.4 c-Myc、Sox2及KLF4在合浦珠母貝各組織中分布

與預(yù)期相符,c-Myc、Sox2和KLF4是3個(gè)非常保守的轉(zhuǎn)錄因子, 它們?cè)诤掀种槟肛惖耐馓啄?、足、生殖腺、?nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和鰓各組織中都有分布。

圖5 Sox2、c-Myc和KLF4基因在合浦珠母貝各組織分布Fig.5 Disstribution of Sox2, c-Myc and KLF4 genes in tissues of Pinctada fucata

3 討論與小結(jié)

自2006年Yamanaka[1]研究小組利用轉(zhuǎn)錄因子在體外將小鼠體細(xì)胞成功誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞之后,Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4作為多能因子被深入和廣泛的研究。作者在合浦珠母貝外套膜轉(zhuǎn)錄組中找到c-Myc、Sox2及KLF4基因的片段, 并通過(guò)RACE-PCR技術(shù)克隆得到它們的全長(zhǎng)序列, 不僅為以后研究合浦珠母貝中 ips 細(xì)胞奠定基礎(chǔ), 或許還可為生物礦化的研究提供新的切入點(diǎn)。

生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到 c-Myc編碼蛋白的一段HLH功能域, 以及 Myc-N保守性片段, 這些都是c-Myc基因編碼蛋白的典型特征, 可以通過(guò)與 DNA特異位點(diǎn)結(jié)合而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控, 從而起到調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的功能。此前已有較多文章報(bào)道過(guò)c-Myc蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中所起的重要作用[14-15]。

而Sox2基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)中預(yù)測(cè)到 HMG-box和Soxp結(jié)構(gòu)域, 正如前文所述, HMG-box存在于高遷移率的基團(tuán)中, 因?yàn)檫@種特性參與到需要改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象的一系列DNA相關(guān)調(diào)控過(guò)程中[13]。而Soxp結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)錄因子參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16], 說(shuō)明合浦珠母貝中Sox2編碼蛋白也極有可能參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中。

KLF4編碼蛋白中含有兩個(gè)與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的鋅指雙域。因此, 這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在合浦珠母貝中同樣在DNA水平起著調(diào)控基因表達(dá)的作用, 對(duì)它們的研究具有重要的意義。

在于其他已知基因的同源性比對(duì)中, 作者發(fā)現(xiàn)在與合浦珠母貝相近的物種尤其是牡蠣中都找到與這 3種基因編碼的氨基酸殘基序列具有較高相似性的蛋白, 表明它們?cè)谶z傳進(jìn)化上具有更近的關(guān)系。而合浦珠母貝中預(yù)測(cè)的這3種蛋白都在N端序列與其他已知蛋白有較大差異, 因此根據(jù)這一點(diǎn)可以猜想它們功能上的差異, 可以有針對(duì)性的進(jìn)一步研究。而諸如牡蠣等其他生物中相關(guān)蛋白的研究[19-21]也可為合浦珠母貝中這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的研究提供重要參考價(jià)值。

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(本文編輯: 梁德海)

Cloning and sequence analysis of iPS related transcription factors fromPinctada fucata

ZHANG Ruo-yun, XU Guang-rui, PAN Cong, XIE Li-ping, WANG Hong-zhong, ZHANG Gui-you, ZHANG Rong-qing
(School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Jan., 22, 2014

ips cells; transcription factors; cloning;Pinctada fucata

The four transcription factors namedSox2,Oct4,c-MycandKLF4can reprogram differentiated in vitro culture cells to an embryonic-like state, in another name, ips cells. The complete gene sequence ofc-Myc,Sox2andKLF4fromPinctada fucatawas amplified by RACE PCR. The complete sequence ofc-Mycgene was 1585 bp and the complete ORF length was 1131 bp which encoded a protein with 376 amino acid residues. The analysis of protein structure showed c-Myc protein had the conservative HLH and Myc-N domains, which have the DNA-binding function.Sox2gene has the complete sequence of 1908 bp and the complete ORF length of 990 bp which encoded a protein with 329 amino acid residues. And the Sox2 protein had the conservative HMG-box and Soxp domains, which have the DNA-regulation function.KLF4gene was 2268 bp long and the complete ORF length was 624 bp which encoded a protein with 207 amino acid residues. And the KLF4 protein had two zf-H2C2_2 domains, which have the DNA-binding function. Blast analysis indicated the three deduced amino acid sequences of the c-Myc, Sox2 and KLF4 genes fromP. fucatashowed high homology with proteins fromCrassostrea gigas. RT-PCR result shows that these three genes were expressed in all six tissues fromP. fucataincluding mantle, foot, gonal, visceral mass, adductor muscle and gill, suggesting that these genes were conservative transcriptional factors. Our study inspires the work on cell culture and research inP. fucata.

S823.3

A

1000-3096(2014)04-0007-08

10.11759/hykx20130922001

2014-01-22;

2014-05-12

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2010CB126405)

張若云(1987-), 女, 江蘇徐州人, 碩士, 主要從事生物礦化研究, E-mail: zhangry61@ 126.com