楊官品, 李斐斐

(1. 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué) 海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 山東 青島 266003)

工程微生物發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇: 生物乙醇開發(fā)新方向

Fermenting brown algal carbohydrates into ethanol with engineered microorganisms: A new horizon for bioethanol production

楊官品1,2, 李斐斐1

(1. 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué) 海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 山東 青島 266003)

生物質(zhì)(biomass)是生產(chǎn)生物燃油和日用品的天然可再生資源。用生物質(zhì)生產(chǎn)燃油和日用品有助于解決糧食、環(huán)境、能源等重大問題。遺傳育種、生物技術(shù)、化學(xué)加工、工程技術(shù)等領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步和整合, 正在逐步使利用生物質(zhì)生產(chǎn)燃油和日用品成為可能。其中, 最具代表意義的是發(fā)酵生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇。攀升的油價(jià)和保護(hù)化石燃料資源的壓力, 使人們力圖用工程微生物發(fā)酵生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃油和日用品, 遺傳工程修飾和改造工業(yè)微生物, 規(guī)?；_發(fā)多樣生物質(zhì)[1-2]。玉米和甘蔗可做工業(yè)用, 但“食物-燃油”憂慮(concerns)可能終結(jié)這一路經(jīng)。木質(zhì)纖維素來源豐富, 但處理木質(zhì)纖維素釋放單糖, 成本高,環(huán)境壓力大[3-5]。因此, 需要全新思路和策略開發(fā)利用非木質(zhì)纖維素生物質(zhì), 海洋大型褐藻是新希望。

褐藻具備生產(chǎn)燃油和日用化學(xué)品理想海洋生物質(zhì)的突出優(yōu)點(diǎn): 不占用耕地、不使用肥料、不使用淡水。這些都是其他生物質(zhì)的致命弱點(diǎn)。栽培褐藻可克服有關(guān)土地利用的擔(dān)憂, 避免對食物供給的沖擊。褐藻已有悠久栽培, 用于提取褐藻膠、甘露醇、食用或做動(dòng)物飼料、肥料和各種多聚物原料。世界上許多國家都栽培褐藻, 年產(chǎn)1500萬t左右[6]。褐藻不含木質(zhì)素, 其多糖可通過簡單研磨、舂碾等溶解于水,發(fā)酵前不需耗能的前處理。有報(bào)告稱每公頃可年產(chǎn)59t干褐藻生物質(zhì), 每單位干褐藻生物質(zhì)產(chǎn) 0.254單位乙醇[6]。按照這樣的估計(jì), 每公頃可年產(chǎn)19 000L乙醇, 比甘蔗高約2倍, 比玉米高約5倍[7]。用包括各種藻(algae)在內(nèi)的海洋生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇已引起廣泛重視[8]。利用海洋藻類生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇克服了陸源生物質(zhì)相關(guān)的問題, 且單位面積產(chǎn)量更高(本文中藻類指那些大規(guī)模栽培或可采集大型海藻, 如海帶等,不含微藻)。

1 遺傳工程改良工業(yè)釀酒酵母發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解物生產(chǎn)乙醇

2008年, 全世界生產(chǎn)了約870億L生物燃油, 相當(dāng)于德國當(dāng)年消耗量。但這些生物燃油都是用食用碳水化合物如玉米淀粉和甘蔗糖生產(chǎn)的。這引起人們對凈能源(net energy)獲得、溫室氣體效應(yīng)(greenhouse gas effects)、燃油生產(chǎn)-食物、飼料和纖維生產(chǎn)用地競爭、燃油生產(chǎn)-生態(tài)系統(tǒng)功能維持用地競爭的擔(dān)憂。發(fā)酵非食用植物組分(木質(zhì)纖維素)生產(chǎn)乙醇將使人們繞過這些擔(dān)憂[7]。

木質(zhì)纖維素(lignocellulose)由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicelluloses)和木質(zhì)素(lignin)構(gòu)成。纖維素是平行排列的多聚纖維二糖(cellobiose)構(gòu)成的結(jié)晶體。半纖維素是由阿拉伯糖(arabinose), 乳糖(galactose), 葡萄糖(glucose), 甘露糖(mannose)和木糖(xylose)等構(gòu)成的分支多糖, 還含有乙酸(acetic acid), 糖醛酸(glucuronic acid), 阿魏酸(ferulic acid)等成分。根據(jù)單糖成分, 半纖維素可分為木聚糖(xylan), 甘露聚糖(mannan), 葡聚糖(glucan), 糖醛酸木聚糖(glucuronoxylan), 阿拉伯聚糖(arabinoxylan)等。纖維素排列較緊密, 水解較難; 而半纖維素的單糖多樣、糖鏈短、分支、非結(jié)晶, 水解比纖維素容易。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和成分發(fā)雜, 與纖維素和半纖維素結(jié)合緊密, 水解最難。纖維素多用酶法水解, 而半纖維素多用稀酸水解, 木質(zhì)素多用堿水解[9]。

發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇被認(rèn)為是纖維素生物乙醇最主要研究內(nèi)容[10]。但木質(zhì)纖維素不能直接發(fā)酵成乙醇, 必須進(jìn)行前期處理, 降解成纖維二糖、纖維三糖(cellotriose)、纖維四糖(cellotetrose )等混合物構(gòu)成的纖維糊精(cellodextrin)、木糖、葡萄糖等簡單糖后才能發(fā)酵成乙醇。來源不同種類植物的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物存在區(qū)別, 但一般含有約 70%纖維糊精和葡萄糖和約 30%的木糖[11]。將這些水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成生物乙醇需要有效利用纖維糊精、木糖和葡萄糖的微生物[5,12]。

因缺少木糖同化途徑, 工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能發(fā)酵葡萄糖, 但不能發(fā)酵木糖。但釀酒酵母經(jīng)戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway, PPP)可以將戊糖(pentose)轉(zhuǎn)換成丙酮酸(pyruvate),利用五碳糖。畢赤酵母(新修訂名Scheffersomycesstipitis)含木糖還原酶(xylose reductase, XR)和木酮糖脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)基因, 是自然界已發(fā)現(xiàn)的最有效的木糖發(fā)酵菌[13-14], 但它不是成熟的工業(yè)酵母。如果將畢赤酵母的XR和XDH基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母, 就能將木糖導(dǎo)入PPP途徑, 賦予釀酒酵母發(fā)酵木糖能力[15-16]。釀酒酵母存在內(nèi)源木酮糖激酶(xylulokinase, XK)基因, 其過表達(dá)或?qū)氘叧嘟湍改就羌っ富? 都能顯著改善釀酒酵母木糖發(fā)酵能力[17-19]。但長期努力獲得的工程釀酒酵母達(dá)不到畢赤酵母發(fā)酵木糖、工程釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量、發(fā)酵效率和乙醇耐受度, 不符合工程釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)。XR更多利用NADPH而XDH只能利用NAD+, NADPH與NADH因缺少酶難以相互轉(zhuǎn)換。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)不平衡、木酮糖積累、木糖發(fā)酵效率低[20-21]。另外, 微生物優(yōu)先發(fā)酵葡萄糖, 被消耗完之前抑制其他糖發(fā)酵。葡萄糖發(fā)酵積累的乙醇, 會(huì)加劇乙醇耐受度問題。

畢赤酵母(Pichiapastoris, 新修訂名Scheffersomycesstipitis)不是成熟工業(yè)酵母, 但能利用木糖合成乙醇。釀酒酵母是成熟的工業(yè)酵母, 但不能利用木糖。將畢赤酵母木糖代謝基因整合到釀酒酵母染色體上, 使釀酒酵母獲得利用木糖合成乙醇能力。同時(shí)引入正常和突變的木糖還原酶基因, 使 NADPH和NADH平衡利用。將來源鏈孢霉(Neurosporacrassa)的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和β-葡萄糖苷酶基因整合到釀酒酵母染色體上, 使釀酒酵母獲得細(xì)胞內(nèi)降解纖維二糖生成葡萄糖、代謝纖維二糖和木糖生成乙醇的能力, 并克服了酵母優(yōu)先利用葡萄糖, 積累木糖的缺陷, 提高了釀酒酵母乙醇耐受度和乙醇發(fā)酵效率。木質(zhì)纖維素經(jīng)前期處理獲得纖維二糖和木糖, 利用遺傳工程改良釀酒酵母就能發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇(圖 1)。但木質(zhì)纖維素前期處理困難, 對環(huán)境影響大, 木質(zhì)纖維素目前不是最理想乙醇生產(chǎn)生物質(zhì)。

葡萄糖和木糖同步發(fā)酵有望克服葡萄糖抑制問題, 而纖維二糖和木糖同步發(fā)酵能克服葡萄糖抑制問題, 同時(shí)也能發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇,因?yàn)槟举|(zhì)纖維素水解產(chǎn)物主要是纖維糊精(纖維二糖為主)、木糖和葡萄糖(少量), 纖維二糖可進(jìn)一步降解為葡萄糖。但是, 實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo), 必須首先解決纖維糊精向釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的問題。纖維素分解真菌鏈孢霉(Neurospora crassa)具有纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和β-葡萄糖苷酶[22], 但不是工業(yè)微生物。將鏈孢霉纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(例如, cellodextrin transporter 1)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)基因轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)入畢赤酵母XR、XDH和 XK(將木糖導(dǎo)入戊糖磷酸途徑)基因的工程釀酒酵母(存在內(nèi)源β-葡萄糖苷酶), 就能實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖同步發(fā)酵、纖維二糖和木糖同步發(fā)酵, 將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵成乙醇。另外, 同時(shí)轉(zhuǎn)入原始XR和突變XR基因, 以使細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)平衡,減少木酮糖積累, 提高發(fā)酵效率。原始XR更多利用DADPH, 而突變XR更多利用NADH, 這樣, 細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)平衡, 木糖醇積累減少。另外, 在質(zhì)粒上表達(dá)β-葡萄糖苷酶, 利用質(zhì)粒多拷貝特點(diǎn), 控制β-葡萄糖苷酶活性和纖維二糖降解成葡萄糖速度, 克服葡萄糖限制, 實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖同步發(fā)酵。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物含有少量葡萄糖。獲得的工程釀酒酵母優(yōu)先利用這些葡萄糖后就轉(zhuǎn)入同步發(fā)酵纖維二糖和木糖, 獲得了發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇的理想產(chǎn)量和發(fā)酵效率[23]。這是利用工程工業(yè)釀酒酵母發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇最成功的例子。

將自然界木質(zhì)纖維素利用基因資源導(dǎo)入成熟工業(yè)微生物, 已取得木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的較理想效果, 但將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成生物乙醇,最大的限制是木質(zhì)纖維素的前期處理。這是目前最大的限制。這種限制不在技術(shù), 而在前期處理的經(jīng)濟(jì)成本和環(huán)境壓力?；乇芰恕凹Z食-燃油”沖突, 發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇仍存在成本和環(huán)境限制。

2 遺傳工程改良非工業(yè)細(xì)菌發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇

褐藻碳水化合物有褐藻酸(alginate)、甘露醇(mannitol)和葡聚糖(glucan)。其中, 褐藻的葡聚糖又稱昆布多糖(laminarin)或就是纖維素。褐藻酸是多聚甘露糖醛酸(mannuronate, M)模塊、多聚古洛糖醛酸(guluronate, G)模塊、或兩者混合模塊組成的線性多聚糖醛酸(polyuronic acid), 占干重20%～40%[24]。發(fā)酵甘露醇和昆布多糖生產(chǎn)乙醇已有報(bào)道[25-27]。

圖2 遺傳工程改良鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇代謝途徑

很多細(xì)菌降解、同化利用褐藻酸, 但已有工業(yè)細(xì)菌不能發(fā)酵褐藻酸。褐藻酸分解細(xì)菌合成褐藻酸裂解酶(alginate lyases, Alys), 經(jīng)內(nèi)解聚β消除反應(yīng)(endolytic β-elimination reaction)解聚褐藻酸, 形成寡聚褐藻酸, 再經(jīng)寡聚褐藻酸裂解酶(oligoalginatelyase, Oal)外解聚, 形成不飽和單體并變構(gòu)成脫氧赤鮮 己 酮 糖 醛 酸 (4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid, DEH), DEH還原酶(DehR)還原DEH, 形成酮脫氧葡萄糖醛酸(2-keto-3-deoxy-D-gluconate, KDG), KDG 進(jìn)入恩-杜氏途徑(Netner Doudoroff pathway), KDG激酶(KdgK)和 KDG-6-磷酸醛縮酶(KDG-6-P aldolase, KDGPA/Eda)將其代謝成丙酮酸和甘油醛-3-磷酸, 同化利用褐藻酸[28-30]。鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)經(jīng)褐藻酸結(jié)合蛋白(alginate-binding proteins)和 ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporters, ABC transporters)形成的超級(jí)通道吸收利用褐藻酸[31-32]。

鞘氨醇單胞菌具有坑洞結(jié)構(gòu)。褐藻酸結(jié)合蛋白和ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成轉(zhuǎn)運(yùn)褐藻酸通道。進(jìn)入細(xì)胞后, 外褐藻酸裂解酶和內(nèi)褐藻酸裂解酶分解褐藻酸形成不飽和糖醛酸, 自動(dòng)變構(gòu)成脫氧赤鮮己酮糖醛酸后, 被還原成酮脫氧葡萄糖醛酸, 最后經(jīng)恩-杜氏途徑代謝成丙酮酸。用來源運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶基因和來源鞘氨醇單胞菌的啟動(dòng)子構(gòu)建重組質(zhì)粒, 并調(diào)整基因拷貝數(shù), 使鞘氨醇單胞菌平衡表達(dá)兩個(gè)基因, 獲得代謝丙酮酸生成乙醇的能力(圖 2)。但鞘氨醇單胞菌不是成熟工業(yè)細(xì)菌, 遺傳操作工具少, 遺傳工程改良困難, 發(fā)酵效能難以提高。

能代謝到丙酮酸, 就有希望經(jīng)遺傳工程改良合成各種需要的物質(zhì), 包括乙醇。從丙酮酸開始, 只要丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)和乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ADH)兩種酶作用, 就能生成乙醇。乳酸是乙醇發(fā)酵的主要副產(chǎn)物。只要將乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)基因敲除, 就能消除乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)能厭氧發(fā)酵單糖生產(chǎn)乙醇, 其代謝途徑簡單, 代謝副產(chǎn)物少, 乙醇產(chǎn)率高, 具有工業(yè)細(xì)菌潛力。將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的PDC和ADH基因轉(zhuǎn)入鞘氨醇單胞菌, 可構(gòu)建發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇途徑。Takeda等[33]在質(zhì)粒載體上表達(dá)ADH基因和串聯(lián)的PDC基因, 構(gòu)建了發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇的遺傳工程修飾鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp. A1)。但是,鞘氨醇單胞菌缺乏常規(guī)工業(yè)發(fā)酵條件適用性, 不具備完善遺傳操作工具, 缺少大腸桿菌遺傳操作方便性和工業(yè)發(fā)酵適用性。這將限制快速遺傳操作鞘氨醇單胞菌, 優(yōu)化其發(fā)酵性能, 減少發(fā)酵副產(chǎn)物[1]。

3 遺傳工程改良大腸桿菌發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇

從基因元件考慮, 遺傳工程改良成熟工業(yè)大腸桿菌發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇最合理。微生物發(fā)酵單位重葡聚糖和甘露醇分別產(chǎn)0.08和0.12單位重乙醇[6]。但目前還沒有發(fā)酵褐藻酸的工業(yè)微生物。發(fā)酵葡聚糖和甘露醇生產(chǎn)乙醇, 也達(dá)不到發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇的效率。例如, 釀酒酵母發(fā)酵糖海帶(Laminaria saccharina; 現(xiàn)修訂為Saccharina latissima)葡聚糖僅產(chǎn)約 0.45%體積乙醇[25]。發(fā)酵甘露醇生產(chǎn)乙醇還產(chǎn)生過剩還原當(dāng)量(reducing equivalent), 使細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)失衡。因?yàn)楦事洞冀?jīng)甘露醇脫氫酶氧化成果糖后進(jìn)入恩-杜氏途徑, 代謝成乙醇。而甘露醇氧化同時(shí)也生成 NADH, 造成細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)失衡。只有在微氧環(huán)境中, 或在轉(zhuǎn)氫酶作用下還原NADP+, 使電子分流, 才能再生 NAD+, 克服這一問題, 可多數(shù)微生物沒有轉(zhuǎn)氫酶, 因而不能在無氧環(huán)境下發(fā)酵甘露糖生產(chǎn)乙醇[26]。微氧環(huán)境中, 棕櫚發(fā)酵菌(Zymobacter palmae)發(fā)酵單位重甘露醇僅產(chǎn)生0.38單位重乙醇[26]。細(xì)菌和酵母都能發(fā)酵葡聚糖和甘露醇。棕櫚發(fā)酵菌可同時(shí)發(fā)酵極北海帶(Laminaria hyperborea, 現(xiàn)修訂為Saccharina hyperborea)葡聚糖和甘露醇, 單位體積極北海帶葡聚糖和甘露醇產(chǎn)生約1.6%單位體積乙醇[26-27]。如果能實(shí)現(xiàn)褐藻酸與葡聚糖、甘露醇同步發(fā)酵, 不僅增加了發(fā)酵糖總量,實(shí)現(xiàn)褐藻全部糖的利用, 而且發(fā)酵褐藻酸消耗還原當(dāng)量, 可平衡甘露醇發(fā)酵導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)失衡[34]。

大腸桿菌可代謝甘露醇和葡萄糖。在最成熟工業(yè)大腸桿菌中構(gòu)建發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇的途徑, 可實(shí)現(xiàn)褐藻碳水化合物同步發(fā)酵。大腸桿菌已用來發(fā)酵生產(chǎn)一系列產(chǎn)物, 如乙醇、聚酮化合物(polyketides)、植物天然產(chǎn)物、脂肪酸乙脂、烷烴(alkanes)、丙二醇(propanediol)和丁二醇(butanediol)等[34]。因此,在大腸桿菌中構(gòu)建了發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇途徑就相當(dāng)于在大腸桿菌中構(gòu)建了發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇途徑, 也為發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)生物乙醇和其他日用品搭建了基礎(chǔ)平臺(tái)。

構(gòu)建大腸桿菌發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇途徑第一個(gè)目標(biāo)就是胞外分解褐藻酸成為單糖或寡糖的酶系。有很多細(xì)菌都能分解褐藻酸, 但分解產(chǎn)物多是寡糖而不是單糖。因此, 只要將褐藻酸分解成寡糖就算實(shí)現(xiàn)了第一個(gè)目標(biāo)。假交替單胞菌 SM0524(Pseudoalteromonassp. SM0524)合成32kD、能分解褐藻酸多聚M或多聚G模塊、形成二到四聚糖的胞外褐藻酸裂解酶(alginate lyase, Aly)[35]。大腸桿菌抗原 43 (antigen 43, Ag43)可自主轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。Ag43前體有信號(hào)態(tài)區(qū)域(signal peptide, SP)、α(乘客)結(jié)構(gòu)域、β(載體)結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域間間隔。成熟時(shí), α、β結(jié)構(gòu)域形成聚合體并粘附(無共價(jià)結(jié)合)在大腸桿菌表面。Ag43已被開發(fā)成細(xì)菌抗原和蛋白表面展示系統(tǒng)[36]。將Ag43的信號(hào)肽、Aly、部分α結(jié)構(gòu)域、β結(jié)構(gòu)域組合成融合蛋白, Wargacki et al. (2012)[34]成功在大腸桿菌中表達(dá)了假交替單胞菌SM0524的Aly, 并完全分泌到培養(yǎng)基。融合Aly可以將褐藻酸降解成2～5個(gè)糖單體的褐藻酸寡糖(oligoalginate)。

將褐藻酸降解成褐藻酸寡糖, 大腸桿菌必須先將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)才能利用。因此, 構(gòu)建大腸桿菌發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇的目標(biāo)就是轉(zhuǎn)運(yùn)褐藻酸寡糖。盡管很多細(xì)菌都能降解褐藻酸, 但僅在鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)發(fā)現(xiàn)褐藻酸結(jié)合蛋白(alginatebinding proteins)和 ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporters, ABC transporters)形成的超級(jí)通道, 能將褐藻酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中[37]。這是一個(gè)龐大的系統(tǒng), 向大腸桿菌引入這一系統(tǒng)非常困難, 也從來沒有人嘗試過。但是, 菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)果膠寡糖(oligopectin)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)簡單得多,只有 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(TogMNAB)蛋白和同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(TogT)[38]。果膠(pectin)和褐藻酸有相似性, 而果膠寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在細(xì)菌中廣泛存在。因此, 在降解褐藻酸的細(xì)菌中可能存在相似的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。通過生物信息學(xué)搜尋, Wargacki等[34]在燦爛弧菌 12B01 (Vibrio splendidus12B01)基因組序列(AAMR00000000)中發(fā)現(xiàn)一區(qū)域可能編碼相似的系統(tǒng), 但用常規(guī)方法克隆這一區(qū)域比較困難。Wargacki等[34]構(gòu)建了該細(xì)菌的fosmid文庫, 經(jīng)功能篩選獲得一約36 kb片段, 該片段編碼褐藻酸寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)和分解的所有蛋白, 包括大腸桿菌本身也存在的KDGK和KDGPA編碼基因。逐個(gè)刪除基因后進(jìn)行功能驗(yàn)證, 最后闡明了該片段編碼基因的功能。為了更有效地轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝褐藻酸寡糖, Wargacki等[34]搜尋基因組序列, 在上述片段兩側(cè)發(fā)現(xiàn)一些輔助褐藻酸轉(zhuǎn)運(yùn)和深度降解的基因, 擴(kuò)增后與分離的片段組合在一起, 發(fā)現(xiàn)褐藻酸代謝效率得到顯著提升。最后, Wargacki等[34]將褐藻酸裂解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解等基因通過同緣重組方式全部整合在大腸桿菌染色體上, 使大腸桿菌獲得了代謝褐藻酸的能力。

圖3 遺傳工程改良大腸桿菌發(fā)酵褐藻主要碳水化合物生產(chǎn)乙醇代謝通路

假交替單胞菌 SM0524(Pseudoalteromonassp. SM0524)來源褐藻酸裂解酶基因與大腸桿菌抗原 43 (antigen 43, Ag43)部分區(qū)域(信號(hào)肽、部分α結(jié)構(gòu)域和β結(jié)構(gòu)域)編碼序列融合, 整合到大腸桿菌染色體中,使大腸桿菌表達(dá)并完全分泌褐藻酸裂解酶, 使褐藻酸降解成褐藻酸寡糖。將來源燦爛弧菌12B01(Vibrio splendidus12B01)轉(zhuǎn)運(yùn)、降解褐藻酸寡糖的操縱子連同其兩側(cè)輔助基因整合到大腸桿菌染色體上, 使大腸桿菌獲得轉(zhuǎn)運(yùn)和進(jìn)一步降解褐藻酸寡糖的能力。將來源運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶吉亞尼整合到大腸桿菌染色體上, 使褐藻酸降解產(chǎn)物能發(fā)酵成乙醇。為減小醋酸等副產(chǎn)物合成, 通過同緣重組, 使大腸桿菌喪失醋酸、丁酸、甲酸等合成能力。組合這些遺傳工程改良措施, 使成熟的工業(yè)發(fā)酵大腸桿菌獲得發(fā)酵褐藻酸生產(chǎn)乙醇的能力(圖3)。因?yàn)榇竽c桿菌本身能發(fā)酵甘露醇和葡聚糖, 遺傳工程改良大腸桿菌能發(fā)酵所有褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇。將甘露醇轉(zhuǎn)化成果糖的甘露醇脫氫酶具有NAD+利用偏好, 會(huì)導(dǎo)致洗淘氧化還原太失衡, 但引入的褐藻酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解途徑能利用NADH, 使甘露醇發(fā)酵效能提高。

到這里, 經(jīng)遺傳工程修飾的成熟的工業(yè)大腸桿菌就能在無氧條件下同步發(fā)酵褐藻酸、甘露醇和葡聚糖(海帶等褐藻全部碳水化合物)生產(chǎn)乙醇。為進(jìn)一步提高乙醇生產(chǎn)效率, Wargacki等[34]又將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, Pdc)和乙醇脫氫酶 B(alcohol dehydrogenase B, AdhB)基因[39]整合到大腸桿菌染色體上。為減少發(fā)酵副產(chǎn)品, 如乳酸等, 他們失活了大腸桿菌的相關(guān)基因。

優(yōu)化條件下, 獲得的工程大腸桿菌在 25～30℃發(fā)酵褐藻模擬糖組分(5 褐藻酸∶8 甘露醇 ∶1葡萄糖)能獲得20 g/L或2.4%(V/V)的乙醇產(chǎn)率。當(dāng)發(fā)酵海帶(Laminaria japonica, 現(xiàn)調(diào)整為Saccharina japonica)碳水化合物時(shí)產(chǎn)生約4.7%(V/V)乙醇。這一濃度已達(dá)到最近報(bào)道的用釀酒酵母發(fā)酵纖維氨化膨脹(ammonia fiber expansion, AFEX)處理的玉米秸稈木質(zhì)纖維素獲得的乙醇濃度(40 g/L或5.1%,V/V)[40]。這相當(dāng)于每單位重生物質(zhì)產(chǎn)約0.281單位重乙醇, 或每單位重總糖(褐藻酸、甘露醇、葡聚糖)產(chǎn)約 0.41單位重乙醇, 達(dá)到理論產(chǎn)量的80%以上。另外, 83%的乙醇是在48 h內(nèi)產(chǎn)生的, 產(chǎn)率是0.64 g/(L·h)。糖消耗比是0.5 mol 甘露醇 ∶1mol褐藻酸。大腸桿菌可以代謝甘露醇和葡萄糖, 但褐藻酸同步發(fā)酵增加了乙醇濃度。因此, 褐藻酸發(fā)酵有助于修復(fù)甘露醇發(fā)酵導(dǎo)致的氧化還原狀態(tài)失衡。發(fā)酵海帶碳水化合物仍有低濃度(2g/L)乳酸積累, 這可能是甲基乙二醛酸途徑(methylglyoxylate pathway)導(dǎo)致的現(xiàn)象[41]。

4 適應(yīng)生物乙醇生產(chǎn)的褐藻(主要是海帶)育種策略

生物乙醇可整合到現(xiàn)有燃油系統(tǒng), 添加量可達(dá)10%。如改良發(fā)動(dòng)機(jī), 添加量可高達(dá) 85%[42]。2007年, 我國海帶栽培面積約400 km2, 總產(chǎn)約80萬t/hm2(干重), 平均每公頃 20.5t/hm2。褐藻理論產(chǎn)量59t/hm2[34]。我國栽培海帶每公頃產(chǎn)量只有理論值的35%, 提高單位面積產(chǎn)量還有巨大空間。種間雜交結(jié)合系統(tǒng)選育培育的品種(如901)產(chǎn)量增加70%[43], 商業(yè)栽培的雜交海帶(如東方2號(hào)、東方3號(hào))單位面積產(chǎn)量提高 50%～60%[44-45], 單位面積產(chǎn)量只有理論值的一半左右。

大幅度提高單位面積產(chǎn)量將越來越困難, 但大幅提高單位面積光能轉(zhuǎn)化率空間巨大。海帶是冷水性藻, 盡管在我國栽培多年, 其栽培海域水溫超過其自然群體海域水溫, 也形成了次生野生群體(栽培海帶在栽培海域形成的群體, 生長勢弱), 但我國的海帶栽培沒有利用夏季高溫季節(jié)的豐富光能。如果能培育耐高溫或喜高溫海帶, 改變栽培模式, 實(shí)現(xiàn)全年、多輪、跨夏季栽培, 單位面積產(chǎn)量肯定會(huì)顯著提高。另外, 我國采用倒掛式浮繩網(wǎng)栽培模式, 海帶最敏感的生長點(diǎn)接近海面, 藻體頂端接受的光能隨生長逐步減少。如果能培育耐強(qiáng)光品種, 或耐弱光,或即耐強(qiáng)光也適應(yīng)弱光的品種, 單位面積產(chǎn)量也能顯著提高。目前, 我國只有遼寧、山東和福建(小部分)近海栽培海帶。增加栽培總面積是提高總產(chǎn)量的根本出路。不論是耐高溫, 還是耐低溫, 不論是抗強(qiáng)光, 還是耐弱光海帶品種, 都能有效增加海帶總栽培面積, 延長栽培季節(jié), 提高單位面積光能轉(zhuǎn)化率,有利于形成褐藻乙醇產(chǎn)業(yè)。

過去, 海帶遺傳改良基本上圍繞產(chǎn)量提高和抗逆性, 沒有涉及生化組分改良(可比擬作物品質(zhì)改良)。但一度提出高糖(或富糖, 指葡聚糖)和低(甘露)醇品種培育目標(biāo)?，F(xiàn)在工程大腸桿菌可發(fā)酵褐藻全部碳水化合物生產(chǎn)乙醇。適應(yīng)生物乙醇生產(chǎn)海帶生物質(zhì)只要增加產(chǎn)量、改善抗逆性、增加栽培面積、改變栽培模式就行。實(shí)現(xiàn)與養(yǎng)殖動(dòng)物的協(xié)調(diào)發(fā)展, 結(jié)合水質(zhì)改良和環(huán)境修復(fù), 即可獲得褐藻生物質(zhì), 也可以產(chǎn)生環(huán)境效益和生態(tài)效益。大幅提高海帶總產(chǎn)量也將為就業(yè)、農(nóng)民增收做出顯著貢獻(xiàn)。

我國有海帶栽培面積約400 km2, 略小于膠州灣面積(446 km2)。如果達(dá)到理論年產(chǎn)量, 即59t/hm2, 按每單位重褐藻生物質(zhì)生產(chǎn)0.254單位重乙醇計(jì)算, 每公頃每年可生產(chǎn)乙醇1.9萬L。這樣, 一個(gè)膠州灣可年產(chǎn)7.6億L乙醇, 是2010年我國年燃油消耗量(約90億L)的1/118。將5%燃油替換成生物乙醇, 只需要用 6個(gè)膠州灣面積海域栽培海帶, 并達(dá)到理論產(chǎn)量。這不到我國海域面積(約300萬km2)的千分之一。最為關(guān)鍵的是, 栽培海帶不需淡水、不需土地、不使用化肥, 對解決當(dāng)前人口、環(huán)境、能源等重大問題具有特殊意義。

5 結(jié)語

海帶是不可多得的適用生物乙醇生產(chǎn)的生物質(zhì)。我國是最大規(guī)模栽培海帶的國家, 也是海帶生物學(xué)研究和遺傳育種強(qiáng)國。盡管在遺傳工程修飾成熟工業(yè)微生物發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇方面我國已落后他國, 但我國有豐富的褐藻生物質(zhì)資源。重視源頭技術(shù)開發(fā)、倡導(dǎo)發(fā)酵褐藻碳水化合物生產(chǎn)乙醇, 有望使我國躋身發(fā)酵褐藻生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇國家前列。

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(本文編輯: 康亦兼)

Q178.53

A

1000-3096(2014)04-0088-08

10.11759/hykx20130307002

2013-03-07;

2013-08-26

中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所開放課題

楊官品(1963-), 男, 湖北荊州人, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事海洋生物方面的研究, 電話: 0532-82031636, E-mail: yguanpin@mail.ouc.edu.cn