彭全材, 宋金明, 張全斌, 林 強

(中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

四種綠藻和四種褐藻脂肪酸組成的比較研究

彭全材, 宋金明, 張全斌, 林 強

(中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

對綠藻門和褐藻門 8種大型海藻的脂肪酸組成進行了研究, 發(fā)現(xiàn)兩類海藻都有其特征脂肪酸或有幾種特征脂肪酸組合做為其化學分類的標記。4種綠藻的主要脂肪酸是16: 0、16: 1ω7、18: 4ω3、18: 1ω7、18: 2ω6、18: 3ω3、18: 1ω9, 其中18: 1ω7和18: 3ω3的含量相對較高; 4種褐藻中16: 0、18: 1ω9、18: 2ω6、18: 3ω3、18: 4ω3、20: 5ω3、20: 4ω6的含量占絕對優(yōu)勢, 十八碳和二十碳多不飽和脂肪酸是褐藻門脂肪酸的典型特征。另外, 褐藻中含有較高含量的 EPA, 海帶和裙帶菜尤為明顯。對 2門類 5屬 8株海藻所含脂肪酸進行聚類分析的結(jié)果顯示海藻各門及種間的親緣關(guān)系, 表明利用靜態(tài)條件下海藻脂肪酸的聚類分析結(jié)果, 可在一定程度上判別海藻在分類上親緣關(guān)系的遠近, 海藻脂肪酸組成的差異可以作為海藻分類的一個輔助技術(shù)手段。

脂肪酸; 化學分類; 綠藻; 褐藻

海藻是古老而又原始的低等植物, 其結(jié)構(gòu)簡單,沒有根、莖、葉的分化。海藻屬于孢子繁殖, 生活在海水里, 沒有開花結(jié)果的現(xiàn)象, 亦屬于隱花植物。海藻對海洋初級生產(chǎn)力的貢獻約 10%[1], 是海洋食物鏈中重要的一環(huán)[2], 是繼魚類之后人們研究得最多的富含高度不飽和脂肪酸(PUFA, Polyunsaturated fatty acids)的生物, 它能合成PUFA并通過食物鏈轉(zhuǎn)移到不能直接合成這些多烯酸的魚類或其他水生生物中去[3]。海藻的脂肪酸豐富多樣, 主要包括 C14-C22的飽和脂肪酸(Saturated fatty acids, SFA)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids, MUFA)和多元不飽和脂肪酸(PUFA)[4], SFAs對橈足類的繁殖有重要的相關(guān)性[5], PUFAs在幼魚的存活、發(fā)育、能量儲存、組織結(jié)構(gòu)發(fā)育以及細胞膜的形成等方面具有重要作用[6]。20: 5ω3(EPA, Eicosapntemacnioc Acid)和22: 6ω3(DHA, Docosahexaenoic Acid)是很多動物幼體發(fā)育的必需脂肪酸, 對生物神經(jīng)組織的形成、眼、視網(wǎng)膜和腦的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[7,8]。有研究表明, 浮游動物無法合成n-3和n-6的多元不飽和脂肪酸, 而這些脂肪酸對其生殖功能起著重要作用[9], 因此缺乏這類營養(yǎng)必然會影響到浮游動物的產(chǎn)卵和孵化。此外, 脂肪酸還通常被用來反映浮游植物群落結(jié)構(gòu)變化[10], 指示海洋動物的攝食選擇性[11]。當赤潮或水華發(fā)生時, 還可以通過監(jiān)測藻類細胞脂肪酸含量和組成的變化, 推測赤潮或水華的發(fā)展階段[12]。

由于海洋環(huán)境的特殊性, 經(jīng)過長期的自然選擇,海洋藻類與陸地植物相比更富含長鏈高度不飽和脂肪酸; 且各種脂肪酸在不同分類單元海藻中的分布存在異同, 不同種類的藻具有其本身的特征脂肪酸[13-14], 這在化學分類學上有著重要的意義。

本文以采自青島近海的四種綠藻和四種褐藻為研究對象, 研究其脂肪酸的組成的異同。在此基礎(chǔ)上對其營養(yǎng)價值的進行探討評價, 并應(yīng)用多元統(tǒng)計方法對目標海藻的脂肪酸組成特征進行分析, 探究脂肪酸在海藻化學分類學中的應(yīng)用, 確定不同研究對象的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所有海藻均采自青島近海, 采集后瀝干海水, 放入4℃冰箱備用。所選樣品為兩門8種, 包括綠藻4種(孔石莼、緣管滸苔、羽藻、滸苔)和褐藻4種(鼠尾藻、海帶、裙帶菜 、馬尾藻)。樣本編號見表1。

表1 實驗用海藻代碼及分類學位置Tab.1 Names, codes and characters of seaweeds used in this experiment

1.2 脂肪酸分析測定

1.2.1 樣品處理

樣品處理過程參照Bai等[15]的方法。取鮮樣品10.0 g, 將其放入灼燒過的玻璃培養(yǎng)皿中并均勻平鋪(厚度不超過2 cm), 將培養(yǎng)皿放入–20 ℃預(yù)凍10 h,取出用冷凍干燥機干燥20 h。將干燥好的海藻樣品進行研磨, 過40目篩。準確稱取粉碎過篩后的樣品40 mg, 置于 450℃灼燒 4 h的具塞尖底玻璃管中,加C19: 0內(nèi)標溶液1 mL, 分別加入2 mL二氯甲烷和1 mL甲醇, 冰浴下超聲破碎提取10 min, 加入1.0 mL超純水, 棄除上清液, 用巴斯德吸管吸取下層二氯甲烷溶液, 重復以上提取步驟 3次, 合并二氯甲烷層溶液, 用無水硫酸鈉除水, 氮氣吹干, 加入0.5 mL正己烷后, 再加入5 mL 2 mol/L的硫酸/甲醇溶液, 于80℃水浴中甲酯化4 h, 冷卻后, 分2次加入 5 mL正己烷進行萃取, 將萃取后的正己烷溶液氮氣吹干, 加正己烷定容至1 mL, 搖勻, 0.20 μm濾膜過濾, 待測。

1.2.2 色譜條件

脂肪酸的測定采用氣相色譜法[16], 采用 DBFFAP彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm); 載氣流速: 1.0 mL/min; 程序升溫: 50 ℃保持3 min, 再以10 ℃/min升至230 ℃, 保持15 min; 載氣: 氮氣;柱頭壓: 35.5 kPa; 分流進樣, 分流比10∶1; 進樣口溫度: 220 ℃; 火焰離子化檢測器( FID)溫度: 280 ℃;進樣體積: 1.0 μL。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

脂肪酸含量采用內(nèi)標法進行定量, 然后再換算成百分含量。通過SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行聚類分析和數(shù)理統(tǒng)計, 所有統(tǒng)計分析均采用SPSS16.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻脂肪酸組成

8種海藻的脂肪酸組成如表2所示。t檢驗顯示兩大門類海藻的總脂肪酸含量無明顯差別(P＞0.05,表3)。4種綠藻平均總脂肪酸含量(15.91mg/g)要高于4種褐藻的平均總脂肪酸含量(11.24 mg/g)。羽藻的總脂肪酸含量最高, 達到 38.79 mg/g, 而鼠尾藻的總脂肪酸含量僅有 6.87 mg/g。

8種海藻中SFAs含量高于MUFAs和PUFAs; 16碳脂肪酸總量(C16)高于 18碳脂肪酸總量(C18), 20碳脂肪酸總量(C20)含量最低(表2)?？资?、緣管滸苔、羽藻、滸苔等4種綠藻主要脂肪酸為16: 0、18: 1ω9、18: 3ω3、18: 2ω6、18: 1ω7, 鼠尾藻、海帶、裙帶菜、馬尾藻等4種褐藻主要脂肪酸為16: 0、18: 1ω9、18: 2ω6、18: 3ω3、20: 4ω6、20: 5ω3。綠藻中18: 1ω7脂肪酸含量高于褐藻, 褐藻中18: 1ω9脂肪酸的含量要遠遠高于綠藻(表2)。

2.2 脂肪酸組成統(tǒng)計分析

以脂肪酸的含量作為變量, 對 8種海藻進行了聚類分析 (圖1)。當類合并距離尺度約為18時可為2類, 類Ⅰ包括UK、EL、EC、BP, 均屬于綠藻門, 類Ⅱ包括ST、SE、UP、LA, 隸屬于褐藻門。當類合并距離尺度定義為4時, 8種海藻可分為5類: 類Ⅰ包括UK、EL、EC, 類Ⅱ為BP, 類Ⅲ包括ST和SE, 類Ⅳ為UP, 類Ⅴ為LA。

當8 種海藻分成 2 類時, 脂肪酸18: 3ω3、18: 1ω7、18: 1ω9有明顯差別(P＜0.05, 表4); 8種海藻分成5類時, 脂肪酸14: 0、16: 0、18: 1ω9、18: 1ω7、18: 3ω3、18: 4ω3、20: 1ω9、20: 5ω3、20: 2ω6有明顯差別(P＜0.05, 表4)。

表2 8 種海藻脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid compositions of eight seaweeds

表3 綠藻與褐藻總脂肪酸的顯著性檢驗Tab.3 The statistical significance test of average difference between the Green algae and Brown algae

圖1 幾種海藻脂肪酸組成的聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis based on the fatty acid compositions of eight seaweeds species

表4 海藻中各脂肪酸的顯著性檢驗Tab.4 The statistical significance test of average difference between the algaes

對8種海藻中飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)、n-3多不飽和脂肪酸(ω3)、n-6多不飽和脂肪酸PUFA(ω6)、16碳脂肪酸(C16)、18碳脂肪酸(C18)、20碳脂肪酸(C20)、總脂肪酸含量(TFA)等參數(shù)進行主成分分析(圖 2),結(jié)果顯示, 第一主成分和第二主成分累積方差貢獻率達到 83.499%, 其中第一主成分占到總方差的56.026%, 第二主成分占27.473%。

圖2 8個海藻樣品的主成分分析結(jié)果Fig.2 Analysis of Principal Component for Classification of eight samples

表5 總方差解釋表Tab.5 Total variance explained

通過主成分1可以看出, 藻3(BP)、藻6(LA)位于主成分1的一端, 其他藻類位于主成分1的另一端,結(jié)合表6可知, LA中C20和ω6脂肪酸含量較高, BP中TFA、PUFA、C18、ω3、ω6的含量都較高; 其他6種藻中SFA、C16比較高, 因此, 主成分1能夠解釋為 BP、LA和其他藻脂肪酸組成的差別。綠藻和褐藻分別位于主成分 2維度的兩端, 差異主要表現(xiàn)在綠藻的SFA、PUFA、ω3、C16、C18的含量較高, 而褐藻 MUFA、ω6、C20的含量較高。因此, 主成分 2 能夠為解釋綠藻和褐藻中脂肪酸組成的差異。

表6 矩陣組成表Tab.6 Component matrix

3 討論

3.1 海藻脂肪酸組成差異在其分類中的應(yīng)用

早在20 世紀40 年代Millner[17]就提出可以用脂肪酸作為藻類的分類依據(jù)。經(jīng)過過半個世紀的時間, 特征脂肪酸或幾種脂肪酸的組合在藻類化學分類方面的研究和運用在國內(nèi)外已經(jīng)有較多的報道[18,19]。海藻種類繁多, 最初的分類鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征, 但僅從形態(tài)對其進行分類并不可靠, 需進一步從生理生化甚至分子水平進行系統(tǒng)研究[20], 而海藻的脂肪酸組成也是研究分類的重要依據(jù)[21]。石娟等[22]通過測定并比較了小新月菱形藻和三角褐指藻的色素組成及脂肪酸組成, 發(fā)現(xiàn)二者的色素及脂肪酸組成一致,僅個別成分的相對含量有所不同, 得到了二者親緣關(guān)系很近的結(jié)論。

本文8種海藻脂肪酸組成聚類分析結(jié)果顯示, 4種綠藻和 4種褐藻可以明顯地分為兩組, 當距離尺度約為4時, 則分為5類, 這與生物分類學共分為5個屬一致。UK、EL、EC屬于石莼屬, BP屬于羽藻屬, ST、SE同屬于馬尾藻屬, UP屬于裙帶菜屬, LA屬于海帶屬, 結(jié)果與現(xiàn)行國際通用的海藻分類結(jié)果完全吻合, 進一步證明這種化學分類的可行性。利用靜態(tài)條件下海藻脂肪酸的聚類分析結(jié)果, 完全可以作為海藻分類的一個良好的輔助技術(shù)手段。

3.2 海藻脂肪酸組成特征分析及評價

本文所選8種海藻分屬兩門, 5個屬。4種綠藻的主要脂肪酸有16: 0、16: 1ω7、18: 4ω3、18: 1ω7、18: 2ω6、18: 3ω3、18: 1ω9。綠藻中石莼屬和羽藻屬都含有高含量的18: 1ω7、18: 3ω3, 李憲璀等[23]也研究證明大型綠藻的 18: 3ω3 脂肪酸含量比較高, 高含量的18: 1ω7、18: 3ω3是綠藻脂肪酸組成的突出特征。大多數(shù)藻類中都含有比較豐富的 EPA, 但是本文所選4種綠藻只含有少量的20: 5ω3(EPA)和微量的 22: 6ω3(DHA), 這進一步證明了Renaud 等[24]提出的綠藻不含或很少含 EPA 和 DHA的論點。4種褐藻中16: 0、18: 1ω9、18: 2ω6、18: 3ω3、18: 4ω3、20: 5ω3、20: 4ω6的含量占絕對優(yōu)勢, 十八碳高度不飽和脂肪酸和二十碳脂肪酸的含量較高, 這與褐藻門脂肪酸的典型特征相一致, 海帶目的海帶所含 18: 2ω6、20: 4ω6分別為8.64%、7.10%, 而屬同一目的裙帶菜只含 4.13%、3.53%, 海帶比裙帶菜富含 n-6系列高度不飽和脂肪酸多, 可能是海帶脂肪酸組成的一個重要特征。綠藻門與褐藻門脂肪酸組分的一個重要區(qū)別是所有綠藻都含有EPA但是其含量比褐藻低。從主要成分分析可以看出, 羽藻中 TFA、PUFA、C18、ω3、ω6的含量較高, 其中ω3、ω6脂肪酸很多都是機體所必需的脂肪酸, 所以羽藻有著非常高的營養(yǎng)價值。

本研究中兩類海藻中都含有豐富的 MUFA、PUFA、ω3、ω6脂肪酸, 可以為海洋動物提供機體所需要的必需脂肪酸。綠藻不含或很少含 EPA 和DHA, 褐藻含 EPA 和 DHA也不多, 但是 EPA 和DHA又是機體必需的脂肪酸。因此, 在漁業(yè)養(yǎng)殖時,飼料的配對過程中加入適量的EPA 和 DHA對魚類的成活率和繁殖率會有一定的促進作用。通過8種海藻的脂肪酸組分研究, 利用靜態(tài)條件下海藻脂肪酸的聚類分析, 將8個不同種類的海藻按其脂肪酸的內(nèi)在數(shù)理統(tǒng)計規(guī)律劃歸2大類、5小類, 這與傳統(tǒng)的生物分類學上8種海藻隸屬于兩門五屬基本吻合。研究證明脂肪酸種類的不同及其相對含量高低等組成特性,可以用來輔助判別海藻可能所處的分類學地位。

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(本文編輯: 康亦兼)

Comparison of fatty acid compositions of four green algae and four brown algae

PENG Quan-cai, SONG Jin-ming, ZHANG Quan-Bin, LIN Qiang
(Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

May, 30, 2013

fatty acid; chemotaxonomy markers; green algae; brown algae

The fatty acid compositions of eight seaweeds from green algae and brown algae were analyzed. Some specific fatty acid profiles of the seaweeds as chemotaxonomy markers were found. The characteristic fatty acids of the four green algae are 16: 0, 16: 1ω7, 18: 4ω3, 18: 1ω7, 18: 2ω6, 18: 3ω3 and 18: 1ω9, and the dominative ones are 18: 1ω7 and 18: 3ω3. The dominative fatty acid profiles of the four brown algaes were 16: 0, 18: 1ω9, 18: 2ω6, 18: 3ω3, 18: 4ω3, 20: 5ω3 and 20: 4ω6. And the representative feature of the brown algae was the higher contents of octadeca-carbon unsaturated fatty acid and twenty-carbon unsaturated fatty acid. In addition, the brown algae contained higher levels of EPA which was more obvious inLaminaria japonica AreschandUndaria pinnatifida Sur.The analysis result of 8 seaweeds from 5 genus of 2 phylums by carrying out a cluster analysis of fatty acids showed , there is a good truly relationship among these lines to some extent. This study provides evidence that fatty acid compositions of seaweeds may be a good assistive technical method for classification and quantitive evaluation.

Q176, Q547

A

1000-3096(2014)04-0027-07

10.11759/hykx20130530003

2013-05-30;

2013-07-04

國家 863資助項目課題(2010AA093701); 中國科學院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目(yg2010020)

彭全材(1983-), 男, 江西萍鄉(xiāng)人, 碩士, 主要從事分析檢測與植物化學研究, E-mail: quancaipeng@163.com; 宋金明, 通信作者,研究員, 博士生導師. E-mail: jmsong@qdio.ac.cn