王 倩, 譚訓(xùn)剛 孫 威 尤 鋒 張培軍

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京, 100049)

牙鲆NPY的體外表達(dá)及體內(nèi)檢測

王 倩1,2, 譚訓(xùn)剛1, 孫 威1, 尤 鋒1, 張培軍1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京, 100049)

神經(jīng)肽Y (Neuropeptide Y, NPY)被普遍認(rèn)為是一種重要的促食因子, 在調(diào)節(jié)魚類的攝食行為方面起著至關(guān)重要的作用。為進(jìn)一步研究牙鲆NPY蛋白的生物學(xué)功能, 作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信號肽的全長序列(f-NPY), 利用原核表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行體外重組表達(dá), 篩選出誘導(dǎo)劑IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L及最佳誘導(dǎo)時(shí)間3 h; 此外, 根據(jù)牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制備了多克隆抗體并通過Western blot驗(yàn)證該多抗能夠有效檢驗(yàn)重組NPY及牙鲆體內(nèi)NPY的表達(dá)。研究結(jié)果為研究重組牙鲆NPY蛋白在牙鲆水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用及檢測提供了依據(jù)。

神經(jīng)肽Y; 原核表達(dá); 重組蛋白; 多克隆抗體

神經(jīng)肽 Y(Neuropeptide Y, NPY)與結(jié)構(gòu)肽 YY (peptide YY, PYY)、胰多肽(pancreatic polypeptide, PP)相似, 被認(rèn)為屬于胰多肽家族[1]。NPY 廣泛存在于各種脊椎動(dòng)物中, 多由 36個(gè)氨基酸組成, 且物種間高度保守[2]。NPY主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)中, 尤其在腦部含量很高。NPY以信號分子的形式參與到體內(nèi)多種生理調(diào)節(jié)過程如血壓調(diào)節(jié)、交感神經(jīng)系統(tǒng)節(jié)律、晝夜節(jié)律及攝食等[3]。金魚(Carassius auratus)中, 側(cè)腦室內(nèi)注射NPY可顯著提高攝食量, 而加入NPY受體拮抗物可降低這種效應(yīng);禁食能夠引起NPY表達(dá)量的上升[4]。在其他魚類中如大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)、銀大馬哈魚(O.kisutch)、斑點(diǎn)叉尾 (Ictalurus punctatus)、冬鰩(Raja ocellata)、巴南牙鲆(Paralichthys orbignyanus)等中也發(fā)現(xiàn)禁食會(huì)使下丘腦中NPY mRNA的表達(dá)量增加[5-8]。通過腹腔注射將重組的NPY蛋白注射到羅非魚(Oreochromissp.)中, 可以促進(jìn)其攝食量及體質(zhì)量的增加[9]。因此NPY被認(rèn)為是一種十分重要的攝食調(diào)控因子, 在調(diào)節(jié)魚類的攝食行為方面起著至關(guān)重要的作用。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一, 生長率是養(yǎng)殖的重要指標(biāo)之一, NPY的促進(jìn)攝食作用可對提高牙鲆的生長率有重要意義。但是目前有關(guān)牙鲆 NPY生物學(xué)功能的研究主要集中在RNA水平[8,10-12], 蛋白水平的研究還未見報(bào)道。為進(jìn)一步研究牙鲆 NPY的生物學(xué)作用, 本實(shí)驗(yàn)在克隆牙鲆NPY基因的基礎(chǔ)上, 構(gòu)建NPY原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行體外原核表達(dá); 根據(jù)牙鲆NPY蛋白序列制備了NPY多克隆抗體, 可有效地檢驗(yàn)牙鲆內(nèi)源 NPY, 從而為進(jìn)一步研究牙鲆NPY蛋白的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及抗體

限制性內(nèi)切酶(TaKaRa, 大連), T4 Ligase (Promega, 美國),PfuDNA 聚合酶(天根, 北京), 超低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(Solarbio, 北京), Anti-His 抗體(天根, 北京), 辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)(中杉金橋, 北京), 辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG(H+L)(中杉金橋, 北京)。

大腸桿菌BL-21(DE3)及質(zhì)粒pPROEX? HTa由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 NPY表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的牙鲆NPYcDNA序列(GenBank 登錄號: AB055211.1), 分別設(shè)計(jì)全長NPY(f-NPY)及成熟肽NPY(m-NPY)的引物(表 1), 其中m-NPY的上游引物在 5′端根據(jù) Kozak規(guī)則加入ACCATGGGA, 以提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效率, 下游引物在5′端加入TCA進(jìn)行翻譯的終止。使用Pfu高保真酶擴(kuò)增目的片段, 插入pPROEX? HTa質(zhì)粒的NcoI酶切位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3), 經(jīng)LB+Amp培養(yǎng)基篩選陽性菌落, 提取質(zhì)粒后分別以f-NPY-F/R和m-NPY-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定并進(jìn)行測序, 篩選到編碼框正確的陽性重組菌分別命名為f-NPY/ HTa、m-NPY/HTa。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3 NPY重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

挑取f-NPY/HTa、m-NPY/HTa單菌落于5 mL LB+ Amp培養(yǎng)基中37℃、200 r/min過夜培養(yǎng), 次日以1%的接種量接于50 mL LB+Amp培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至A600達(dá)到0.8, 此時(shí)取出1 mL培養(yǎng)液作為對照樣品T0, 然后向剩余培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。

為確定誘導(dǎo)劑濃度對重組蛋白表達(dá)的影響, 設(shè)定IPTG濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.5、2.0和3.0 mol/L,培養(yǎng)3 h后進(jìn)行取樣。為確定誘導(dǎo)時(shí)間對重組蛋白表達(dá)量的影響, 固定IPTG 濃度為0.8 mmol/L, f-NPY取樣時(shí)間為分別為誘導(dǎo)后1、2、3、4和5 h; m-NPY取樣時(shí)間設(shè)置為誘導(dǎo)后3 h和4 h。

將樣品在6000 rpm離心5 min后棄上清, 用50 μL PBS和 50 μL 2×SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸菌體,煮沸5 min后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。f-NPY所用分離膠濃度為16%, 使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色; m-NPY使用分離膠濃度為20%的Tricine-SDS-PAGE, 并使用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色。

1.4 Western blot分析

為進(jìn)一步確認(rèn)NPY重組蛋白的表達(dá), 作者利用His表達(dá)標(biāo)簽進(jìn)行 Western blot分析。蛋白樣品由SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜, 以濃度為5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉, 然后加入 1∶1000稀釋的Anti-His 抗體作為一抗室溫孵育1 h, PBST洗3x 5 min后, 加入 1∶1000稀釋的羊抗鼠二抗室溫孵育 1 h, PBST洗3x 5 min后用新鮮配制的DAB顯色液(0.2 g/L DAB, 0.1% H2O2)進(jìn)行顯色。

1.5 NPY多克隆抗體檢測牙鲆內(nèi)源NPY蛋白

牙鲆多克隆抗體由天津賽爾生物技術(shù)有限公司合成, 多肽抗原序列為 YSALRHYINLITRQRY, 是牙鲆NPY的第49～64位氨基酸, 位于胰多肽超家族(PAH superfamily)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。為檢測該抗體的有效性,作者取100尾24 hph (孵化后24 h) 的牙鲆仔魚, 加入50 μL PBS和50 μL 2×SDS-PAGE 樣品緩沖液煮沸5 min, 即可作為樣品與m-NPY誘導(dǎo)蛋白一起進(jìn)行Western blot檢測。方法同1.4, 其中一抗為1∶500稀釋的NPY多克隆抗體, 二抗為1∶1000稀釋的羊抗兔抗體。另外, 以 1∶1000稀釋的Anti-His 抗體為一抗檢測m-NPY誘導(dǎo)樣品作為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 NPY表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒m-NPY/HTa、f-NPY/HTa的鑒定Fig. 1 Identification of recombinant expression plasmid m-NPY/Hta and f-NPY/HTa

使用Pfu高保真酶擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的PCR片段, PCR產(chǎn)物回收后插入pPROEX? HTa質(zhì)粒的NcoI酶切位點(diǎn), 陽性重組質(zhì)粒分別以f-NPY-F/ R和m-NPY-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 可以檢驗(yàn)出各自的NPY條帶(圖1), 測序結(jié)果也表明克隆得到的為預(yù)期條帶, 插入方向正確且編碼框沒有發(fā)生改變,即成功獲得 NPY重組表達(dá)菌f-NPY/HTa、m-NPY/ HTa。

重組質(zhì)粒插入的f-NPY為336 bp, 可編碼100個(gè)氨基酸, 加上 pPROEX? HTa質(zhì)粒的融合標(biāo)簽, 融合蛋白的分子量理論值為14 kDa;m-NPY為120 bp,可編碼40個(gè)氨基酸, 加上pPROEX? HTa質(zhì)粒的融合標(biāo)簽, 融合蛋白的分子量理論值為7 kDa。

2.2 NPY重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

全長NPY重組蛋白f-NPY及成熟肽NPY重組蛋白m-NPY在E.coliBL21 (DE3)中表達(dá)為帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0.8 mmol/L IPTG、37℃條件下經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后, f-NPY重組蛋白很快產(chǎn)生, 而對照樣品沒有該蛋白條帶。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長, 重組蛋白的量不斷增加, 到3 h時(shí), 重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最大, 此后進(jìn)入平臺(tái)期。因此將誘導(dǎo)時(shí)間定為3 h(圖2a)。在優(yōu)化f-NPY誘導(dǎo)時(shí)間的基礎(chǔ)上, 設(shè)定了m-NPY誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)為3 h和4 h, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)取樣點(diǎn) m-NPY的表達(dá)量沒有明顯變化, 因此同樣將誘導(dǎo)時(shí)間定為3 h(圖3a)。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃, 誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí), 隨著IPTG濃度改變, f-NPY和m-NPY重組蛋白表達(dá)量變化均不明顯(圖2b, 圖3b), 因此采用較小濃度0.8 mmol/L作為表達(dá)的最佳誘導(dǎo)濃度。此外, Western blot以Anti-His鼠單克隆抗體為一抗, 結(jié)果顯示預(yù)期大小處有單一條帶顯色, 進(jìn)一步確定了含有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白的表達(dá)(圖2 c, 圖3 c)。

圖2 SDS-PAGE及Western blot檢測f-NPY重組蛋白的最佳表達(dá)條件Fig. 2 SDS-PAGE and western blot analysis of the optimal conditions for expression of recombinant f-NPY

圖3 SDS-PAGE及Western blot檢測m-NPY重組蛋白的最佳表達(dá)條件Fig. 3 SDS-PAGE and western blot analysis of the optimal conditions for expression of recombinant m-NPY

2.3 牙鲆內(nèi)源NPY蛋白的檢測

圖 4 多克隆抗體檢測牙鲆內(nèi)源NPY表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of the endogenous flounder NPY with the polyclonal antibody

為分析牙鲆體內(nèi)NPY的表達(dá), 作者根據(jù)NPY的部分氨基酸序列合成了多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)表明該抗體可以檢測到牙鲆仔魚樣品的 NPY表達(dá)(圖 4)。牙鲆 NPY蛋白的理論分子量約為 4 kDa, 比實(shí)驗(yàn)中m-NPY重組蛋白略小, Western blot結(jié)果顯示合成的多抗可以在牙鲆仔魚樣品中檢測到約 4 kDa大小的條帶, 該條帶與兩種抗體處理的m-NPY大小接近。因此作者推論該合成的NPY多克隆抗體可以檢測出內(nèi)源表達(dá)的NPY蛋白。

3 討論與結(jié)論

以往的研究表明, 牙鲆NPY蛋白的組成包括28個(gè)氨基酸的預(yù)測信號肽、36個(gè)氨基酸的成熟肽及32個(gè)氨基酸的C端延伸, 其成熟肽含有甘氨酸-賴氨酸-精氨酸加工位點(diǎn), 與其他魚類的NPY有較高的保守性(鱸魚, 97.2%; 斑馬魚, 94.4%; 金魚, 91.7%)[10]。本研究分別克隆了牙鲆NPY兩種不同形式的基因片段, 全長NPY(f-NPY)及成熟肽NPY(m-NPY), 與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對, 一致性均為100%, 并發(fā)現(xiàn)含有胰多肽超家族(PAH superfamily)結(jié)構(gòu)域。將f-NPY及m-NPY分別插入到表達(dá)質(zhì)粒pPROEXHTa的6xHis標(biāo)簽之后, 利用大腸桿菌表達(dá)菌株BL 21(DE3)獲得重組蛋白。然后對重組蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化, 重組蛋白表達(dá)量的多少與誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間有密切關(guān)系, 而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在選取的范圍內(nèi), 誘導(dǎo)劑濃度的變化對重組蛋白表達(dá)量的影響并不明顯, 主要影響因素是誘導(dǎo)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)最終確定了IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L, 誘導(dǎo)時(shí)間為3 h, 為重組蛋白的大量培養(yǎng)表達(dá)提供了依據(jù)。

研究表明NPY促食的機(jī)制可能是其在室旁核中與Y1[13]或Y5[14]受體結(jié)合后傳出信號, 抑制交感神經(jīng)興奮副交感神經(jīng), 并促進(jìn)生長激素、促性腺激素[15]、促黃體生成素[16]等激素的釋放, 從而增加食欲和采食量并促進(jìn)消化[17]。目前許多魚類物種中都克隆出了NPY并且驗(yàn)證了其促食作用, 因而NPY在促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中有可觀的前景。在牙鲆中的研究還僅限于核酸水平, 而在機(jī)體內(nèi)真正起作用的是蛋白。本實(shí)驗(yàn)得到 NPY重組蛋白, 并制備了多克隆抗體,為在牙鲆中進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了條件。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Expression of recombinant flounder NPY proteinin vitroand detection of endogenous NPY in flounder

WANG Qian1,2, TAN Xun-gang1, SUN Wei1, YOU Feng1, ZHANG Pei-jun1
(1. Experimental Marine Biology Laboratory, Institute of Oceanology, Chinese, Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100049, China)

Apr., 24, 2013

Neuropeptide Y; prokaryotic expression; recombinant protein; polyclonal antibody

Neuropeptide Y (NPY) plays a key role in regulation of food intake in fish, which is essential for aquaculture. In order to investigate the effects of NPY on olive flounder (Paralichthys olivaceus), two types of flounder NPY gene, full length NPY (f-NPY) with signal peptide and mature peptide NPY (m-NPY) without the signal, were cloned into expression vector pPROEXTMHTa and expressed inE.coliBL21 (DE3) respectively. The recombinant NPY proteins were induced by IPTG. The optimal concentration of IPTG was 0.8 mmol/L and the optimal induction time was 3 h. In addition, the NPY polyclonal antibody was prepared according to its amino acid sequence. Western blot analysis confirmed that both the recombinant NPY and the flounder endogenous NPY protein could be detected by the polyclonal antibody. In summary, our study will provide basis for further study on the application of recombinant olive flounder NPY in aquaculture.

Q78

A

1000-3096(2014)04-0015-05

10.11759/hykx20130424003

2013-04-24;

2013-10-16

國家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012AA092203); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31128017); 國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目-水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)(2006DKA30470017)

王倩(1987-), 女, 山東曲阜人, 博士生, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話: 0532-82898559, E-mail: ameliaxing@163.com; 譚訓(xùn)剛, 通信作者, 副研究員, 電話: 0532-82898559, E-mail: tanx@ qdio.ac.cn; 尤鋒, 通信作者, 研究員, 電話: 0532-82898561, E-mail: youfeng@qdio.ac.cn