杜曉鳳, 鄒 寧, 孫東紅, 常 林, 趙 萍

(魯東大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264025)

溫度和光徑對微綠球藻生長及營養(yǎng)成分含量的影響

杜曉鳳, 鄒 寧, 孫東紅, 常 林, 趙 萍

(魯東大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264025)

研究了溫度和光生物反應器的光徑對微綠球藻(Nannochloropsisoculata Hibberd)生長及細胞內(nèi)幾種營養(yǎng)成分含量的影響。結果表明, 溫度對微綠球藻的生長有顯著影響(P<0.05), 對幾種營養(yǎng)成分的含量有極顯著影響(P<0.01), 在 28℃的培養(yǎng)條件下, 細胞生長速度最快, 此時蛋白質含量最高, 為5.66%, 多糖含量最低, 僅為1.47%, 但最大生物產(chǎn)量卻是在30℃的條件下獲得, 總脂與葉綠素a的含量隨溫度的升高而降低, 類胡蘿卜素含量隨溫度升高而增大。光生物反應器的光徑對微綠球藻的生長和總脂、可溶性蛋白、色素的含量有極顯著影響(P<0.01), 對多糖含量有顯著影響(P<0.05), 比生長速率、最高細胞密度和單位體積產(chǎn)量均隨光徑的增大而減小, 單位面積產(chǎn)量隨光徑的增大而增大; 總脂、可溶性蛋白和多糖的含量隨光徑的增大而降低, 葉綠素和類胡蘿卜素含量隨光徑增大而增大, 類胡蘿卜素含量的增大趨勢比葉綠素更明顯。

微綠球藻(Nannochloropsisoculata Hibberd); 溫度; 光徑; 蛋白質; 多糖; 總脂; 色素

微綠球藻是一種海洋單胞藻, 呈球形, 其細胞壁極薄, 易于消化吸收, 加上其易培養(yǎng)、繁殖迅速、營養(yǎng)豐富等特點, 是泥蚶、蟹、蝦等幼苗及輪蟲的優(yōu)良餌料, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用較為廣泛。微綠球藻細胞含有極豐富的二十碳五烯酸(EPA)、蛋白質、多糖等物質, 是健康食品和藥品的重要資源之一[1]。

目前國內(nèi)外對微綠球藻的研究多集中在藻的培養(yǎng)工藝[2-3]、分子系統(tǒng)學[4]及環(huán)境因子對脂肪酸組成及含量[5-7]的影響等方面, 對其培養(yǎng)條件的研究多集中在光照[8]、溫度[6,9-10]、氮源及氮濃度[11-14]、pH[15]等方面。本研究所用反應器為自行研制的氣升式平板光生物反應器, 與傳統(tǒng)反應器相比, 能有效防止污染, 實現(xiàn)高密度純種培養(yǎng), 還可以增加光照面積, 提高光能利用率。作者旨在研究溫度和反應器的光徑對微綠球藻生長狀況的影響, 并分析了各營養(yǎng)成分的含量, 為今后平板光生物反應器的應用及微綠球藻的培養(yǎng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

微綠球藻(Nannochloropsis oculataHibberd)藻種由魯東大學生命科學學院藻類研究所提供。

1.2 培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件

采用氣升式平板光生物反應器, 反應器底部安裝由玻璃條固定的多孔通氣管, 向反應器內(nèi)通入空氣。將反應器和通氣管洗凈, 加滿自來水, 然后按 1 mL/L的量加入次氯酸, 滅菌24 h后, 將自來水倒出, 加入滅菌的培養(yǎng)基和海水, 培養(yǎng)所用海水取自自然海水,過濾滅菌后使用, 培養(yǎng)基配方參見鄒寧等[16]。同時接入相同的藻種, 控制接入后的藻種密度相同或接近,同時在自然光、室溫下進行培養(yǎng), 培養(yǎng)基的初始 pH為8.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗梯度設置

溫度對微綠球藻影響: 選用光徑為 5cm的反應器, 用碘鎢燈做光源, 控制光照強度約為 5000 lx,光周期L: D為10:14, 在碘鎢燈與反應器之間放置加滿水的空白反應器降溫, 控制溫度梯度為: 20、25、28、30、32℃, 每組設置3個平行。

光徑對微綠球藻的影響: 選取光徑分別為 5、10、15、20cm且長度和高度均相同的4組反應器, 每組3個平行, 培養(yǎng)過程測得光照強度為: 1300～31000 lx,白天溫度為23～30℃。

1.3.2 生長測定方法

每天上午9: 00～10: 00取樣, 用紫外分光光度計測定藻液在波長660 nm處的吸光值, 用血球計數(shù)板計數(shù)細胞密度。生長計算公式為: 比生長速率μ= (lnN2?lnN1)/(t2–t1)[17], 其中其中N2為試驗剛進入穩(wěn)定期的細胞數(shù)目,N1為試驗剛進入對數(shù)期的細胞數(shù)目,t2為試驗剛進入穩(wěn)定期的時間,t1為試驗剛進入對數(shù)期的時間。

1.3.3 微藻的采收

采收處于穩(wěn)定期的藻液, 用大型離心機離心, 3 000 r/min離心30 min, 藻泥用去離子水洗2～3次,一部分制成藻泥于冰箱中冷藏保存, 用于測定色素含量; 一部分于電熱鼓風干燥箱中 65℃烘干至恒重,將烘干的藻粉置于干燥皿中待用。

1.3.4 總脂含量的測定

準確稱取 0.15g±0.01g藻粉于具塞試管中, 加入 1 mL蒸餾水, 在混勻器上混勻后, 置于–20℃冰箱中反復凍融3次。加入5mL工業(yè)酒精, 混勻后在室溫下提取 3 h, 將上清液移入離心管中, 加入適量高效活性白土, 于搖床上充分搖勻脫色, 6000 r/min離心5 min, 收集上清于恒重的稱量瓶中, 殘渣返回試管內(nèi)重復提取2次, 合并上清, 將上清于旋轉蒸發(fā)儀中去除提取劑, 稱質量, 計算油脂含量。

油脂含量=(油脂質量/藻粉質量)×100%

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定

準確稱取 0.15g±0.01g藻粉于 5mL離心管中,加入 2 mL蒸餾水, 在混勻器上混勻后, 置于?20℃冰箱中反復凍融3次, 再加入2 mL蒸餾水, 離心收集上清, 殘渣加適量蒸餾水重復離心, 合并上清液,定容到50 mL, 每組采用3個平行。采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[18]。

1.3.6 可溶性多糖含量的測定

準確稱取0.15 g±0.01 g藻粉于5 mL離心管中,加入 2 mL蒸餾水, 在快速混勻器上混勻后, 置于–20℃冰箱中反復凍融3次, 再加入2 mL蒸餾水, 離心收集上清; 殘渣加適量蒸餾水, 于沸水浴中加熱3 h, 離心收集上清。合并上清液并定容到50mL, 每組采用3個平行。采用蒽酮法測定多糖的含量[19]。

1.3.7 色素含量的測定

準確稱取0.15 g±0.01 g藻粉于具塞試管中, 加入 1 mL蒸餾水, 在混勻器上混勻后, 置于?20℃冰箱中反復凍融3次。加入5 mL80%的丙酮, 混勻后置于4℃冰箱內(nèi)提取3 h以上, 上清倒入5 mL離心管中離心, 取上清; 殘渣倒入原試管中, 再加 5 mL 80%丙酮提取3h以上, 離心合并上清, 于25 mL容量瓶中定容。用Arnon法測定色素含量[20]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0軟件進行分析, 以P<0.05為顯著性差異, 以P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 溫度對微綠球藻生長及營養(yǎng)成分含量的影響

2.1.1 溫度對微綠球藻生長的影響

溫度對微綠球藻的生長有顯著影響(P<0.05),如表1所示, 在適宜的溫度條件下, 微綠球藻生長迅速, 30℃實驗組的比生長速率最高, 其次為28℃和32℃實驗組, 3組間差異不顯著; 最高細胞密度隨溫度的升高先升高后降低, 30℃實驗組最高, 32℃實驗組次之, 2組間差異不顯著。單位面積產(chǎn)量和單位體積產(chǎn)量都隨溫度的升高先升高后降低,在 30℃時達到最高, 最高值分別為 1.988 g/(m2·d)和39.598 mg/(m2·d), 這與比生長速率μ和最高細胞密度的變化趨勢一致。可粗略得出微綠球藻的最適生長溫度為28～32℃。

2.1.2 溫度對微綠球藻營養(yǎng)成分含量的影響

表1 溫度對微綠球藻生長的影響Tab.1 Effect of temperature on the growth rate of N. oculata

溫度是影響微藻脂肪含量的重要因子之一, 溫度降低時藻細胞內(nèi)不飽和脂肪酸含量增加, 飽和脂肪酸含量減小[10,21]。溫度對總脂含量有極顯著影響(P<0.01), 由表 2可以看出, 在 20～32℃的溫度范圍內(nèi), 隨著溫度的升高, 微綠球藻細胞內(nèi)的總脂含量呈下降趨勢。James等[22]報道微綠球藻在35℃下生長時, EPA的含量比在25℃和30℃時減少4%; 溫度對可溶性蛋白和多糖含量有極顯著影響(P<0.01), 隨著溫度的升高, 可溶性蛋白含量先升高后降低, 在 28℃條件下達到最高值, 與此相反, 多糖含量先下降后升高, 在 28℃條件下達到最低?？赡苁怯捎谠谶m宜的溫度條件下, 細胞生長迅速, 合成了大量的蛋白, 此時消耗大量的能量, 造成多糖含量減小; 溫度對微綠球藻葉綠素和類胡蘿卜素的含量有極顯著影響(P<0.01), 葉綠素含量隨著溫度的升高而減小, 類胡蘿卜素的含量隨著溫度的升高而增大。

表2 溫度對微綠球藻可溶性蛋白、多糖、色素含量的影響Tab.2 Effect of temperature on the lipid, soluble protein, polysaccharide and pigments contents of N. oculata

2.2 反應器的光徑對微綠球藻生長及營養(yǎng)成分含量的影響

2.2.1 光徑對微綠球藻生長的影響

采用光生物反應器對微綠球藻進行高密度培養(yǎng),通過實驗得出, 反應器的光徑對微綠球藻生長的影響如表3所示。

通過方差分析和多重比較可知, 反應器的光徑對微綠球藻生長的影響極顯著(P<0.01)。微綠球藻在5～20 cm的光徑范圍內(nèi)均能正常生長, 細胞密度與光徑成反比。光徑越大, 反應器內(nèi)部的細胞接受到的有效光源越少, 不能充分的進行光合作用, 光合產(chǎn)物少, 細胞生長慢。

如表 1所示, 比生長速率與最高細胞密度均與光徑成反比。反應器的光徑越小, 細胞的生長速率越高[23]。隨著光徑的增大, 單位面積產(chǎn)量幾乎呈直線上升, 從5 cm的1.931 g/(m2·d)上升到20 cm的3.354 g/ (m2·d)。與此相反, 單位體積產(chǎn)量隨著光徑的增大而降低, 從 5 cm的 38.611 mg/(L·d)下降到 20 cm的17.272 mg/(L·d), 單位體積產(chǎn)量降了2倍多。

2.2.2 光徑對微綠球藻細胞中營養(yǎng)成分含量的影響

光徑對油脂積累有極顯著影響(P< 0.01), 由表4可以看出, 微綠球藻細胞內(nèi)總脂含量與光徑成反比, 5 cm光徑實驗組的總脂含量顯著高于其他組。在短光徑平板反應器中培養(yǎng)微綠球藻, 可以大幅提高EPA 的含量[24]。光徑對可溶性蛋白含量有極顯著影響(P<0.01), 對多糖含量有顯著影響(P< 0.05), 可溶性蛋白和多糖含量均隨著光徑的增大而減小, 可知短光徑的光生物反應器, 不僅有利于增大細胞密度,還有利于有機物物質的積累。光徑對微綠球藻葉綠素和類胡蘿卜素的含量有極顯著影響(P<0.01), 葉綠素和類胡蘿卜素的含量均隨著光徑的增大而增大。在5 cm和10 cm光徑條件下, 類胡蘿卜素的含量高于葉綠素的含量, 且光徑越小, 高出的比例越大, 這與Zou[25]的研究結果一致; 在15 cm和20 cm的光徑條件下, 葉綠素含量高于類胡蘿卜素的含量, 且光徑越大, 高出的比例越大。

3 結論

表3 光徑對微綠球藻生長的影響Tab.3 Effect of optical paths on the growth rate of N. oculata

溫度對微綠球藻的生長有顯著影響, 反應器的光徑有極顯著影響。微綠球藻只有在適宜的溫度條件下才能生長旺盛和積累有機物。而光徑影響細胞接受到的有效光源, 靠近光生物反應器表面區(qū)域內(nèi)的藻細胞才能接受到有效的光源, 光徑小的反應器,表面積體積比大, 光暗循環(huán)周期短, 光合作用效率高, 積累的蛋白質、多糖和總脂的含量高, 但較強光照對色素有一定破壞作用, 所以色素含量較低; 在相同的表面積下, 藻細胞數(shù)目與反應器的光徑成正比, 所以單位面積產(chǎn)量隨著光徑的增大而增高[26-27]。

表4 子光徑對微綠球藻總脂、可溶性蛋白、多糖、色素含量的影響Tab.4 Effect of optical paths on the lipid, soluble protein, polysaccharide and pigments contents of N. oculata

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(本文編輯: 梁德海)

Effect of temperature and optical path on growth rate and accumulation of nutrients ofNannochloropsissp.

DU Xiao-feng, ZOU Ning, SUN Dong-hong, CHANG Lin, ZHAO Ping
(College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China)

Jun., 12, 2013

Nannochloropsissp.; temperature; optical path; protein; polysaccharide; lipid; pigments

The effect of temperature and optical path of flat plate glass reactors on growth rate and organics contents ofNannochloropsissp. was investigated, using a range of optical paths from 5 to 20 cm. The results showed that the temperature had a significant effect on the growth ofNannochloropsis(P<0.05), and a very significant effect on the contents of mutrients (P<0.01). The cell growth had a highest speed at 28℃, when the content of soluble protein reached the maximum and that of polysaccharides reached the minimum. The biomass yield reached the maximum at 30℃. The contents of lipid and chlorophyll decreased with the increase of temperature, while the content of carotenoid increased with the increase of temperature. The optical path of photobioreactors had a very significant effect on the growth ofNannochloropsis(P<0.01). Specific growth rate, maximal cell density (107cell/mL) and yield per unit volume (mg /(L·d) ) decreased with increase in optical path. Yield per unit area (g /(m2·d) ) increased with increased optical path. The contents of lipid, soluble protein, and polysaccharides decreased with increased optical path, but the contents of chlorophyll and carotenoid increased with increased optical path. The increase trend of carotenoids was more obvious than that of chlorophyll. In summary, the optimal optical path determines the optimal culture density, as well as yield per unit volume and the productivity of organics. Under our conditions the optimal optical path for culturingNannochloropsisto accumulate lipid, protein and polysaccharide in plate reactors was 5 cm, the optimal optical path for accumulating pigments was 20 cm.

Q949.2

A

1000-3096(2014)04-0050-05

10.11759/hykx20120419002

2013-06-12;

2014-02-18

杜曉鳳(1985-), 女, 山東臨沂人, 碩士研究生, 研究方向:藻類細胞培養(yǎng)及活性物質的提取, 電話: 15589528961, E-mail: efeng 000999@163.com; 鄒寧, 通信作者, E-mail: ningzou76@126.com