王麗麗，楊軍國(guó)，陳鍵，宋振碩，陳林

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

微孔過(guò)濾對(duì)茶葉兒茶素類和生物堿HPLC檢測(cè)的影響

王麗麗，楊軍國(guó)，陳鍵，宋振碩，陳林*

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

本試驗(yàn)分別選用4種不同材質(zhì)［尼龍66（NL 66）、聚醚砜（PES）、混合纖維素（MCE）和聚四氟乙烯（PTFE）］濾膜過(guò)濾茶樣浸提液，考察微孔濾膜過(guò)濾對(duì)茶葉中沒(méi)食子酸、兒茶素類和嘌呤堿HPLC分析檢測(cè)的影響。結(jié)果表明同種材質(zhì)濾膜連續(xù)過(guò)濾獲得3瓶濾液（約1 mL/瓶）中的沒(méi)食子酸和生物堿含量基本相當(dāng)；尼龍66濾膜過(guò)濾液中的兒茶素含量存在較大的瓶間差異，但PES、MCE和PTFE濾膜過(guò)濾液并無(wú)明顯的先后差別。由此可見(jiàn)，PES、MCE和PTFE等是茶樣浸提液凈化預(yù)處理較為適宜的濾膜材質(zhì)，而吸附作用則可能是引起NL 66濾膜過(guò)濾液中兒茶素類含量測(cè)定結(jié)果不一致的主要原因。

微孔濾膜；茶葉；兒茶素類；生物堿；HPLC

微孔濾膜常用于高效液相色譜法過(guò)濾待測(cè)液和流動(dòng)相，以去除微粒雜質(zhì)，防止堵塞損壞色譜柱，常用孔徑為0.45 μm或0.22 μm[1]。依據(jù)其材質(zhì)可分為水系膜、有機(jī)系膜和通用性膜，通常根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)物提取溶劑的不同來(lái)選擇適宜材質(zhì)的微孔濾膜。目前，市面上常見(jiàn)微孔濾膜有尼龍膜（NL 66）、聚四氟乙烯膜（PFTE）、聚偏氟乙烯膜（PVDF）、混合纖維素膜（MCE）和聚醚砜膜（PES）等多種，適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和（或）水溶液的過(guò)濾[2]。高效液相色譜法是目前茶葉兒茶素含量測(cè)定的主要方法[3]，其浸提液過(guò)濾所涉及到的濾膜材質(zhì)包括尼龍[4-6]、混合纖維素酯[7]、硝酸纖維素[8]和聚丙烯酸[9]等，而多數(shù)方法則較少提及濾膜材質(zhì)，僅注明需用“微孔濾膜”[10-13]或“水系濾膜”[14]。筆者通過(guò)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同材質(zhì)濾膜過(guò)濾后，茶湯中兒茶素類物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果不相一致，甚至個(gè)別濾材對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大。因此本試驗(yàn)比較了尼龍66（NL 66）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚醚砜（PES）和混合纖維素酯（MCE）4種材質(zhì)濾膜過(guò)濾對(duì)茶葉中沒(méi)食子酸（GA）、8種兒茶素（EGC、EGCG、EC、ECG、GC、GCG、C與CG）與3種生物堿（TP、CAF與TB）HPLC檢測(cè)的影響，并篩選出較為適宜的濾膜材料，旨在為茶葉中兒茶素含量的準(zhǔn)確測(cè)定以及保證不同實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果的可比性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試茶樣為自制綠茶，以福云6號(hào)一芽二葉新梢為原料，在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所加工車間制作，加工工藝為：攤放→殺青→揉捻→干燥。表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、可可堿（theobromine，TB）和咖啡堿（caffeine，CAF）購(gòu)自阿拉?。ㄔ噭┥虾Ｓ邢薰?，純度均＞98%；茶堿（theophylline，TP）、沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin，GC）和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）購(gòu)自上海阿達(dá)瑪斯有限公司，純度均＞98%；兒茶素

（catechin，C）和兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin

gallate，CG）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度＞98%；甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich）；甲酸溶液（色譜純，49%～51%（T），F(xiàn)luka）；乙腈（分析純，上海國(guó)藥）。

美國(guó)Agilent 1260型液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵（G1311C VL）、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）和二極管陣列檢測(cè)器（G1315D

VL）；TSKgel ODS-100Z色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，日本Tosoh）；ACD-0502-U實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（重慶頤洋）；A11 basic分析用研磨機(jī)和MS3 basic小型渦旋混合器（德國(guó)IKA）；DHC-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏）；KQ5200DV超聲波清洗器（江蘇昆山超聲）；SKY-200B恒溫?fù)u床（上海蘇坤）；DK-8D型電熱恒溫水浴槽（上海一恒）；有機(jī)系NL 66濾膜（國(guó)產(chǎn)津騰與美國(guó)進(jìn)口PALL 2種，0.45 μm）、水系MCE濾膜（TROODY，0.45 μm）、水系PES濾膜（津騰，0.45 μm）和通用性PTFE濾膜（TROODY，0.45 μm）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣預(yù)處理

采用以下2種方法提取茶樣。1）乙腈浸提法：準(zhǔn)確稱取磨碎茶樣0.200 g，加50%乙腈10 mL，超聲混勻5 min，30℃振蕩浸提40 min。2）純水浸提法：準(zhǔn)確稱取磨碎茶樣0.200 g，加沸水10 mL，渦旋混勻，沸水浴浸提30 min。待提取完畢，將浸提液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，少量提取液潤(rùn)洗瓶壁，定容。取上述溶液適量，用流動(dòng)相A稀釋10倍后過(guò)濾。乙腈浸提液采用有機(jī)系NL 66濾膜（國(guó)產(chǎn)津騰牌與美國(guó)進(jìn)口PALL牌2種）與通用性PTFE濾膜過(guò)濾，純水浸提液采用水系濾膜（PES和MCE 2種材質(zhì)）以及通用性PTFE濾膜過(guò)濾。具體步驟為：一次性注射器移取浸提液適量，使用上述指定濾膜將其依次過(guò)濾至3個(gè)樣品瓶?jī)?nèi)，過(guò)濾量約1mL/瓶，并分別編號(hào)為No.1、No.2和No.3。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：TSKgel ODS-100Z；流動(dòng)相由0.2%（v/v）甲酸水溶液（A相）和甲醇（B相）組成；梯度洗脫程序：83%A（0 min）→55%A（16 min）→83%A（18 min）→83%A（21 min）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40℃；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)系膜過(guò)濾對(duì)茶葉兒茶素類與生物堿分析測(cè)定的影響

50%乙腈提取茶樣，并選用國(guó)產(chǎn)津騰牌與進(jìn)口PALL牌2種品牌的有機(jī)系NL 66濾膜過(guò)濾浸提液，HPLC法測(cè)定其沒(méi)食子酸、兒茶素類和嘌呤堿含量。從表1可以看出，采用2種NL66濾膜過(guò)濾后，12種茶葉組分含量平均值無(wú)明顯差異，說(shuō)明這2種品牌的NL66濾膜對(duì)HPLC測(cè)定的茶葉組分含量影響甚小。結(jié)果還表明，浸提液經(jīng)NL66濾膜連續(xù)過(guò)濾的3瓶濾液中，GA、TB、TP與CAF組分測(cè)得含量無(wú)明顯差異，而8種兒茶素組分含量呈增加趨勢(shì)，如GC、C、EGCG與ECG，國(guó)產(chǎn)膜過(guò)濾后的含量分別從0.397 mg/g、0.957 mg/g、8.463 mg/g、2.812 mg/g增加至0.612 mg/g、1.608 mg/g、33.469 mg/g、12.050 mg/g，即依次增加0.54倍、0.68倍、2.95倍、3.29倍；進(jìn)口膜過(guò)濾后的含量分別從0.339 mg/g、0.942 mg/g、9.566 mg/g、2.799 mg/g增加至0.665 mg/g、1.610 mg/g、30.353 mg/g、10.478 mg/g，即依次增加0.96倍、0.71倍、2.17倍、2.74倍。分析茶葉組分含量變化原因，可能與NL 66濾膜對(duì)兒茶素類物質(zhì)吸附作用相關(guān)，隨著對(duì)其吸附飽和，濾液中兒茶素類含量逐步增加，而這種濾膜對(duì)GA、TB、TP與CAF組分吸附極低。因此，采用尼龍66濾膜過(guò)濾后濾液中兒茶素類含量降低，從而影響了HPLC法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表 1 尼龍66濾膜（國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口2種）對(duì)茶葉中12種組分HPLC檢測(cè)的影響 （單位：mg/g）Table 1 Effects of NL66 membrane（domestic and imported）microfiltration on HPLC determination of 12 compositions in tea

2.2 水系膜過(guò)濾對(duì)茶葉兒茶素類與生物堿分析測(cè)定的影響

茶樣經(jīng)純水提取后，采用PES與MCE 2種水系膜過(guò)濾，HPLC法測(cè)定茶葉組分結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，PES與MCE 2種濾膜分別過(guò)濾的3瓶濾液中，HPLC法測(cè)定的茶葉沒(méi)食子酸、兒茶素類和生物堿堿含量基本無(wú)差異，說(shuō)明這2種水系濾膜對(duì)所測(cè)茶葉組分無(wú)吸附或吸附小。但相對(duì)來(lái)說(shuō)，采用PES濾膜過(guò)濾后，濾液中EGCG、GCG、ECG和CG組分含量No.1比No.2和No.3均小，說(shuō)明PES濾膜首次使用時(shí)對(duì)酯型兒茶素類有少量吸附，鑒于酯型兒茶素是茶葉兒茶素類的主要組分，可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果稍有偏差。而MCE膜過(guò)濾的3瓶濾液中，所測(cè)12個(gè)組分含量基本無(wú)差異，表明MCE濾膜不會(huì)影響HPLC測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑒于此，HPLC法測(cè)定純水浸提的兒茶素等茶葉組分時(shí)，MCE濾膜稍好于PES濾膜，考慮到成本因素，使用PES濾膜時(shí)可預(yù)先用少量浸提液潤(rùn)洗濾膜，以減少吸附作用帶來(lái)的不良影響。

2.3 通用性膜過(guò)濾對(duì)茶葉兒茶素類與生物堿分析測(cè)定的影響

同時(shí)，試驗(yàn)考察了通用性膜PTFE濾膜對(duì)HPLC法測(cè)定茶樣中兒茶素類與生物堿含量的影響（表3）。結(jié)果表明，經(jīng)有機(jī)溶劑或純水提取、PTFE濾膜過(guò)濾后，3瓶濾液中茶葉組分含量值無(wú)明顯差異，說(shuō)明PTFE濾膜對(duì)兒茶素類與生物堿均無(wú)吸附，不會(huì)對(duì)HPLC法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。從結(jié)果來(lái)看，2種提取法所得的浸提液中茶葉組分含量有較大差別，如GC、C、GCG、CG與CAF，其平均值分別為0.530 mg/g（50%乙腈浸提，下同）與9.275 mg/g（純水浸提，下同），1.610 mg/g與3.394 mg/g，ND與16.828 mg/g，ND與3.173 mg/g以及16.085 mg/g與28.406 mg/g，相差1倍以上。這主要是由于提取溶劑、溫度、料液比等不同所致，與濾膜材質(zhì)無(wú)關(guān)。

表 2 水系膜（PES和MCE 2種材質(zhì)）對(duì)茶葉中12種組分HPLC檢測(cè)的影響 單位：mg/gTable 2 Effects of 2 kinds of aquo membrane（PES and MCE）microfiltration on HPLC determination of 12 compositions in tea

表 3 2種溶劑提取下PTFE濾膜對(duì)茶葉中12種組分HPLC檢測(cè)的影響 單位：mg/gTable 3 Effects of PTFE membrane microfiltration on HPLC determination of 12 compositions in tea extracted by 2 kinds of solvents

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)表明，PES、MCE與PTFE 3種材質(zhì)濾膜分別過(guò)濾的3瓶濾液中兒茶素含量相互一致，而采用尼龍66材質(zhì)濾膜過(guò)濾后，兒茶素含量相互差別較大，推測(cè)其原因很可能是尼龍材質(zhì)對(duì)它們的吸附作用，因此不建議選用尼龍66材質(zhì)濾膜。有研究文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道使用尼龍膜過(guò)濾兒茶素溶液，然而這些文獻(xiàn)多以建立HPLC方法為目的，考察重點(diǎn)在于色譜柱、流動(dòng)相組成及洗脫梯度的選擇，所以尼龍66材質(zhì)濾膜對(duì)兒茶素類的吸附作用通常不在考察范圍內(nèi)。但從用于HPLC方法檢測(cè)茶葉組分含量來(lái)說(shuō)，其吸附效果與結(jié)果準(zhǔn)確性呈相關(guān)性，不應(yīng)忽視。一般而言，濾膜適用于樣品溶液與HPLC流動(dòng)相的過(guò)濾，對(duì)保護(hù)色譜柱及輸液泵管系統(tǒng)和進(jìn)樣閥等不被污染具有良好的作用。筆者認(rèn)為，選擇濾膜時(shí)除需考慮它能否濾除不溶性顆粒物外，還應(yīng)考察其材質(zhì)與樣品的相容性，若材質(zhì)對(duì)樣品中待測(cè)組分有吸附作用，就會(huì)影響該組分含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。濾器材質(zhì)對(duì)藥物吸附性研究較多[15-18]，而對(duì)植物提取成分如兒茶素的吸附作用未見(jiàn)報(bào)道，因此關(guān)于它們對(duì)兒茶素的吸附情況及其選擇合理性等亟需關(guān)注。

綜上所述，水提茶樣可選擇MCE材質(zhì)濾膜過(guò)濾，無(wú)需潤(rùn)洗；若使用PES材質(zhì)濾膜，需潤(rùn)洗。過(guò)濾有機(jī)溶劑提茶樣時(shí)，不建議選用尼龍66材質(zhì)濾膜。無(wú)論何種溶劑提取茶樣，均可使用PTFE通用性濾膜過(guò)濾。

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Effects of Microfiltration on HPLC Determination of Catechins and Alkaloids in Tea

WANG Li-li，YANG Jun-guo，CHEN Jian，SONG Zhen-shuo，CHEN Lin*

（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

In this experiment, effects of microfiltration on HPLC determination of catechins and alkaloids in tea were investigated with four different membrane materials, nylon 66（NL 66）, polyether sulfone（PES）, mixed cellulose（MCE） and polytetrafluoroethylene（PTFE）. The results indicated that there was no obvious difference in the contents of gallic acid and alkaloids among three auto sampler vials（approximately 1mL per vial） when the tea infusions were continuously filtered with the same membrane. However, the contents of catechins in the filtrates obtained from NL 66 membrane filtration showed more difference between each vial and less difference would be found for MCE, PES and PTFE membrane filtration. These facts suggested that MCE, PES and PTFE filters were more suitable for pretreatment of tea infusions combined with HPLC determination of tea compositions, and the inaccuracy of HPLC determination of tea catechins with Nylon 66 filter might result from its absorption character.

microporous membrane, tea, catechins, alkaloids, HPLC

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012J01099）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)師制青年科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2012DQB-14）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXTD-1-1302）。

王麗麗（1985-），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶葉生物化學(xué)與天然產(chǎn)物分離純化技術(shù)研究。

陳林（1975-），男，博士，副研究員，主要從事茶葉加工、茶葉生物化學(xué)及綜合利用研究。E-mail：chenlin_xy@163.com。