陳 彬，鄭 晶，王 穎，黃曉蓉，林 杰，彭華毅，邵碧英,*

（1.福建出入境檢驗檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001；3.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

5種葡萄球菌腸毒素基因MPCR-DHPLC檢測方法的建立

陳 彬1,2，鄭 晶1,2，王 穎1,3，黃曉蓉1,2，林 杰1,2，彭華毅1,2，邵碧英1,2,*

（1.福建出入境檢驗檢疫局，福建 福州 350001；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001；3.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

設計合成5 種葡萄球菌腸毒素基因（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）的特異性引物，對聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的反應體系進行優(yōu)化后，建立5 種葡萄球菌腸毒素基因的多重PCR結合變性高效液相色譜（multiplex PCR-denaturing high performance liquid chromatography，MPCR-DHPLC）檢測方法，并進行MPCR-DHPLC檢測特異性及靈敏度的測定，5重PCR-DHPLC檢測靈敏度可達到100 CFU/mL。MPCR-DHPLC方法應用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，具有快速、準確、高通量等優(yōu)點。

金黃色葡萄球菌；腸毒素；多重聚合酶鏈式反應；變性高效液相色譜

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]，其中引起中毒的致病因子是葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）。根據(jù)其血清學特性，SEs可分為5 種分別是SEA、SEB、SEC、SED、SEE。目前檢測SES的方法按照檢測原理不同，分為動物實驗、免疫血清學方法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、生物傳感器等[2-4]。其中PCR技術具有快速、靈敏等特點，已廣泛應用于致病菌的檢測，多重PCR（multiplex PCR，MPCR）是對PCR技術的改進而建立起來的一種體外擴增技術，具有擴增效率高、經濟簡便等特點，在臨床診斷上具有獨特的優(yōu)勢和極高的應用價值[5-7]，也特別適合食品中致病微生物的快速測定[8-10]，在葡萄球菌腸毒素檢測上已有一些報道[11-13]。但多采用凝膠電泳法檢測PCR產物，步驟繁瑣，易造成污染。變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是新進發(fā)展的新技術，由PCR擴增的產物經DHPLC技術進行快速檢測，該技術已在致病微生物檢測上得到應用[14-19]，但在葡萄球菌腸毒素檢測上未見報道。本實驗選取金黃色葡萄球菌5 種腸毒素基因，擬建立5 種腸毒素基因的MPCR-DHPLC檢測方法，分析食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因型分布情況，并用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素快速、高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株

標準菌株5 株，分別是產SEA的金黃色葡萄球菌（ICQQ22024）、產SEC的金黃色葡萄球菌（ICQQ22028）、產SED的金黃色葡萄球菌（ICQQ22003） 中國檢驗檢疫科學研究院；產SEB的金黃色葡萄球菌（F0137）和產SEE的金黃色葡萄球菌（T43）由本實驗室保存；大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076） 上海漢尼公司。

1.2 試劑與儀器

2×Taq PCR Master Mix、dNTP、DNA MarkerⅠ、細菌基因組DNA提取試劑盒、多重PCR擴增試劑盒北京天根生化科技有限公司；三乙基銨乙酸鹽緩沖溶液（three ethyl ammonium acetate buffer solution，TEAA）、DNA標樣 北京市表觀生物技術有限公司。

Tgradient 96梯度PCR儀 德國Biometra公司；PTC 220 PCR儀 美國Bio-Rad公司；WAVE4500變性高效液相色譜儀 美國Transgenomic公司；Biophotometer核酸蛋白儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 引物

根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）上查找5 種葡萄球菌腸毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）基因和特異基因femA的序列，并在美國生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上進行序列比對后篩選各自的特異性擴增片段，利用Primer 5.0軟件設計引物，委托上海生工公司合成以下引物（表1）。引物用TE溶液（pH 8.0）稀釋至濃度為10 μmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗引物Table 1 The primer pairs used for experiments

1.3.2 細菌DNA的提取

各取5 株金黃色葡萄球菌標準菌株凍干粉，分別溶解于7.5%氯化鈉肉湯中，于（36 ±1）℃培養(yǎng)18～24 h，將培養(yǎng)物劃線接種到Baird-Parker平板，（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取平板上典型單菌落接種到5 mL 腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)液中，在臺式恒溫振蕩器（36±1）℃振蕩培養(yǎng)12 h。取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100 ?L，接種于4 mL營養(yǎng)肉湯，（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h。各取1 mL菌懸液，按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA，經1∶10稀釋后，于核酸蛋白儀上測定濃度和純度，并用（Tris+EDTA，TE）溶液（pH 8.0）稀釋至50 ng/?L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 5 種葡萄球菌腸毒素基因多重PCR反應體系的確立

檢測5 種葡萄球菌腸毒素基因中的2 種和3 種各有10個組合，4 種的有5 個組合，2、3、4重和5重PCR反應總體積均為20 ?L，6重PCR反應總體積均為30 ?L。

1.3.3.1 2重PCR反應體系

10×Multi HotSart Buffer 2 μL，Super Pure dNTP 1.6 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.4 μL，相應的DNA模板各1 μL（50 ng），各引物和ddH2O的用量如表2所示。

表2 2重PCR反應體系中引物和ddH O的用量Table 2 The amounts of ddH O and primers used in duplex PCR reaction system

1.3.3.2 3重和4重PCR反應體系

表3 3重PCR反應體系中引物和ddH O的用量Table 3 The amounts of ddH O and primers used in triplex PCRreaction system

表4 4重PCR反應體系中引物和ddH2OO的用量Table 4 The amounts of ddH2OO and primers used in quadruplex PCR reaction system

10×Multi HotSart Buffer 3 μL，Super Pure dNTP 2.4 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.6 μL，相應的DNA模板各1 μL（50 ng），各引物和ddH2O的用量如表3、4所示。

1.3.3.3 5重PCR反應體系

10×Multi HotSart Buffer 4 μL，Super Pure dNTP 3.2 μL，Multi HotSart DNA Polymerase 0.8 μL，相應的DNA模板各1 μL （50ng），SEA-F、SEA-R各0.5 μL，SEB-F、SEB-R各0.8 μL，SEC-F、SEC-R各0.5 μL，SED-F、SED-R各1.0 μL，SEE-F、SEE-R各0.5 μL，ddH2O 0.4 μL。

1.3.3.4 6重PCR反應體系

10×Multi HotSart Buffer 4 ?L，Super Pure dNTP 3.2，Multi HotSart DNA Polymerase 0.8 ?L，相應的DNA模板各1 ?L（50 ng），SEA-F、SEA-R各0.5 ?L，SEB-F、SEB-R各0.8 ?L，SEC-F、SEC-R各0.5 ?L，SED-F、SED-R各1.0 ?L，SEE-F、SEE-R各0.5 ?L，femA-F、femA-R各0.5 ?L，ddH2O 9.4 ?L。PCR反應條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

反應結束后，取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定各引物所加的比例是否合適。

1.3.4 MPCR-DHPLC方法的建立

取上述PCR產物進行DHPLC檢測，上樣量5 μL，洗脫液由緩沖液A（0.1 mmol/L的TEAA）和緩沖液B（0.1 mmol/L的TEAA，含25%乙腈）組成，以0.9 mL/min的流速在50 ℃條件下自動洗脫DNA分子，運行時間為20 min，用峰對應的堿基對大小來判斷PCR產物是否正確。

1.3.5 MPCR-DHPLC檢測特異性的測定

為了驗證該方法的特異性，以金黃色葡萄球菌標準菌株的DNA作為陽性對照，以ddH2O作為空白對照，并以50株非金黃色葡萄球菌的細菌的DNA作為陰性對照，進行MPCR擴增并用DHPLC觀察結果。

1.3.6 MPCR-DHPLC檢測靈敏度的測定

5 種金黃色葡萄球菌標準菌株制成菌懸液后分別1∶10系列稀釋，選擇合適的稀釋度進行菌落計數(shù)，同時按1.3.2節(jié)中方法提取DNA模板，并按照1.3.3節(jié)的反應條件進行MPCR擴增。反應結束后，取5 ?L MPCR產物進行DHPLC檢測。

1.3.7 MPCR-DHPLC方法的應用

將建立的MPCR-DHPLC檢測方法用于本實驗室近年來從食品樣品中分離的80 株金黃色葡萄球菌的檢測。吸取甘油保存的金黃色葡萄球菌菌液50 ?L于BHI培養(yǎng)，（36±1）℃搖床培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌懸液，12 000 r/min離心2 min，棄上清液。若沉淀太少，再取1 mL菌懸液進行離心操作。用試劑盒法提取DNA，進行MPCR-DHPLC檢測。

2 結果與分析

2.1 5 種葡萄球菌腸毒素基因多重PCR反應體系的建立

圖1 PCR產物的電泳結果Fig.1 Electrophoresis of duplex and triplex PCR products

圖2 4、5、6 重PCR產物的電泳結果Fig.2 Electrophoresis of quadruplex, quintuplex and sextuplex PCR products

圖3 MPCR-瓊脂糖凝膠電泳驗證結果Fig.3 Agarose electrophoresis showing the validity of MPCR

實驗建立的多重PCR反應體系均能很好地擴增出相應的腸毒素基因。選用多重PCR擴增試劑盒進行MPCR擴增，5 種腸毒素及femA基因的2～6 重PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1、2所示，各產物對應的條帶清晰，且無雜帶產生，表明經過多層優(yōu)化，確立的引物比例合適，互不干擾，為DHPLC檢測做好基礎。為了觀察6對引物同時擴增的效果，實驗采用5 種葡萄球菌腸毒素產毒株的DNA

模板進行擴增，從1、2重逐級擴增到6重，瓊脂糖凝膠法觀察的結果如圖3所示，MPCR產物中僅擴增到與在PCR反應體系中加入的模板DNA相對應的條帶，沒有任何雜帶的出現(xiàn)，表明MPCR反應體系具有很好的特異性。

2.2 MPCR-DHPLC方法的建立

圖4 MPCR-DHPLC驗證結果Fig.4 Verification of MPCR-DHPLC

DHPLC觀察的結果如圖4所示，5 種葡萄腸毒素及femA基因相對應的陽性峰出現(xiàn)位置與預期吻合，各峰分離清晰，無雜峰產生，表明建立的MPCR-DHPLC檢測方法是可行的。

2.3 MPCR-DHPLC方法的特異性

用建立的MPCR-DHPLC法檢測本實驗室保存的50 株非金黃色葡萄球菌的標準株和分離株的特異性檢測，測定的結果只有金黃色葡萄球菌標準菌株出現(xiàn)預期峰，而非目標菌株均未出現(xiàn)任何峰。以大腸埃希氏菌、沙門氏菌測定結果為例如圖5所示，只有金黃色葡萄球菌標準菌株擴增出了相應的目的條帶，而大腸埃希氏菌、沙門氏菌菌株以及ddH2O均沒有出現(xiàn)任何條帶。測定結果表明建立的MPCR-DHPLC方法的特異性很好。

圖5 5對引物特異性實驗DHPLC觀察結果Fig.5 Specificity of MPCR-DHPLC

2.4 MPCR-DHPLC方法的靈敏度

圖6 MPCR-DHPLC靈敏度測定結果Fig.6 Sensitivity of MPCR-DHPLC

MPCR-DHPLC檢測靈敏度的測定結果如圖6所示，隨著菌含量的逐漸減少，DHPLC檢測結果顯示的特異峰面積越來越小。SEA最低能檢測到53 CFU/mL，SEB能檢測到36 CFU/mL，SEC能檢測到45 CFU/mL，SED能檢測到32 CFU/mL，SEE能檢測到41 CFU/mL。結果顯示，MPCR-DHPLC方法的靈敏度可達到100 CFU/mL。

2.5 MPCR-DHPLC檢測方法的實際應用

將建立的MPCR-DHPLC方法用于本實驗室近幾年從食品樣品中分離的金黃色葡萄球菌的檢測，共檢測了80 株金黃色葡萄球菌。檢測結果顯示，80 株金黃色葡萄球菌中有47 株攜帶腸毒素基因，其中33 株菌只攜帶一種腸毒素基因，13 株菌攜帶兩種腸毒素基因，1 株菌攜帶一種腸毒素基因。同時攜帶多種腸毒素基因的部分樣品采用MPCR-DHPLC方法的檢測結果見圖7。

圖7 MPCR-DHPLC方法檢測食品樣品中分離金葡菌菌株的結果Fig.7 Results of MPCR-DHPLC detection of S. aureus strains isolated from food samples

3 討 論

對于多重PCR反應體系的建立，反應條件的優(yōu)化非常重要，否則可能導致出現(xiàn)假陽性、假陰性，拖帶、涂抹帶或非特異性條帶等結果。引物濃度比例、退火溫度等都影響多重PCR的成敗[20]。本實驗不僅對各引物的濃度進行了優(yōu)化，也對熱啟動DNA聚合酶和dNTP的用量進行了優(yōu)化，經過多方面的優(yōu)化，最后確定了2～6 重PCR反應體系中各引物和試劑的用量。最終確定了2～6 重PCR反應體系的引物的量。有研究[21]表明，多重PCR反應體系中擴增片段的大小和所用引物濃度幾乎呈正相關，即片段大的，引物濃度高。而實驗多次優(yōu)化確定的引物濃度結果同這條規(guī)律并非完全符合，因此建立一個新的MPCR反應體系就要進行實際的優(yōu)化過程。

作為高效快速的分子生物學手段，利用多重PCR體系對細菌目的基因進行檢測和分型已獲得普遍認可。在葡萄球菌腸毒素檢測上不僅快速、靈敏，而且不受葡萄球菌毒素抗體制備和毒素基因表達的限制[22-25]，彌補傳統(tǒng)免疫學檢測方法的不足，但PCR或MPCR產物均采用凝膠電泳的方法，目前尚未見將DHPLC方法應用于葡萄球菌腸毒素檢測及分型的報道。本實驗多重PCR體系是在單一PCR的基礎上，通過合理設計引物，優(yōu)化PCR反應體系，使得在同一反應管內可同時擴增多個目的基因，既節(jié)省試劑，又提高檢測效率。PCR擴增的產物經DHPLC技術進行快速檢測，可同時對金黃色葡萄球菌的5種葡萄球菌腸毒素進行檢測和分型。

傳統(tǒng)的檢測方法采用細菌分離培養(yǎng)方法，對金黃色葡萄球菌的檢測需要3～6 d，對檢出的金黃色葡萄球菌是否產腸毒素，耗時更長。本實驗建立的MPCR-DHPLC檢測方法，從取樣、增菌、DNA提取到出具結果，只需要2 d時間，檢測靈敏度可達到100 CFU/mL，應用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，具有快速、準確、高通量的優(yōu)點。而且，本實驗采用DHPLC方法代替瓊脂糖凝膠電泳，不僅可以省掉點樣、電泳、染色和觀察等較為繁瑣的步驟，還可以避免電泳易受到污染的情況。只需將PCR反應管放入自動進樣器，設定好程序，便能自動完成數(shù)百個樣品的檢測。因此，將建立的MPCR-DHPLC方法應用于食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測，不僅能大大縮短檢測周期，達到高通量檢測的目的，對預防和診斷由腸毒素引起的食物中毒具有很高的應用價值。雖然目前對攜帶這些腸毒素基因型的葡萄球菌的毒性作用尚不明確，但是通過對食品污染監(jiān)測發(fā)現(xiàn)攜帶腸毒素基因的金葡菌時可及時進行預警，另外在由腸毒素引起的食物中毒調查和溯源中有很好的應用價值。

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Development of a Multiplex PCR-DHPLC Detection Method for Five Staphylococcal Enterotoxin Genes

CHEN Bin1,2, ZHENG Jing1,2, WANG Ying1,3, HUANG Xiao-rong1,2, LIN Jie1,2, PENG Hua-yi1,2, SHAO Bi-ying1,2,*
(1. Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fuzhou 350001, China; 3. College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Primer pairs specific for the five staphylococcal enterotoxin genes SEA, SEB, SEC, SED, and SEE were designed and synthesized. Using multiplex polymerase chain reaction coupled with denaturing high performance liquid chromatograph (MPCR-DHPLC), a detection method for these five staphylococcal enterotoxin genes were established after the polymerase chain reaction (PCR) reaction conditions were optimized. The sensitivity and specificity of the detection method were then determined. The results showed that the quintuplex PCR-DHPLC method could detect specifically staphylococcal enterotoxin genes with detection limit of 100 CFU/mL. The MPCR-DHPLC method is useful for the rapid, accurate and high-throughput detection of staphylococcal enterotoxins in food samples.

Staphylococcus aureus; enterotoxin; MPCR; DHPLC

Q93.332

A

1002-6630（2014）24-0243-06

10.7506/spkx1002-6630-201424047

2014-06-30

福建省科技廳自然科學基金項目（2012J01062）；福建局科技項目（FK2012-25）

陳彬（1969—），女，高級工程師，學士，研究方向為食品微生物檢驗。E-mail：chenbin0123@aliyun.com

*通信作者：邵碧英（1973—），女，研究員，博士，研究方向為食品微生物檢驗。E-mail：byshao@sohu.com