席冬華，李維霞，高 晶，阿塔吾拉·鐵木爾，李 玲，吳 斌,*

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法定性定量測定籽瓜中的L-瓜氨酸

席冬華1，李維霞1，高 晶2，阿塔吾拉·鐵木爾3，李 玲1，吳 斌3,*

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830091）

建立一種非衍生化樣品前處理的液相色譜-質(zhì)譜和高效液相色譜方法，對籽瓜中的L-瓜氨酸進行定性、定量分析，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取條件。液相色譜-質(zhì)譜條件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相：10%乙腈和90%甲醇溶液（甲醇-水體積比1∶1）；流速0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量10 μL。在電噴霧離子源正模式、多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式下分析，L-瓜氨酸的定性離子對為m/z 176.09/158.9，m/z 176.09/112.9，定量離子對為m/z 176.09/158.9。高效液相色譜條件：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以0.03 mmol/L磷酸為流動相，流速0.7 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長202 nm。結(jié)果表明：L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 9），平均回收率在95.12%～104.21%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.86%～4.75%（n=3）。籽瓜中含有豐富的L-瓜氨酸，本方法測得籽瓜樣品中L-瓜氨酸的平均含量為0.656～2.563 mg/g。

籽瓜；L-瓜氨酸；非衍生化；液相色譜-質(zhì)譜法；高效液相色譜法

瓜氨酸名稱來源于西瓜的拉丁名Citrullus vulgaris，是首先從西瓜汁中發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)非蛋白質(zhì)α-氨基酸，它具有肽鍵形成的能力，但是不參與蛋白質(zhì)的合成，與大多數(shù)氨基酸構(gòu)像一樣為L型，故又稱為L-瓜氨酸[1]。L-瓜氨酸具有防治前列腺疾病，提高男性性功能、抗衰老、增強免疫力、保持膽固醇正常、診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、維護關(guān)節(jié)運動技能、平衡正常的血糖水平、提高腦力清晰度、護膚祛斑等功效[2]。L-瓜氨酸可以通過化學(xué)合成[3]、發(fā) 酵法、酶法合成[4]和天然產(chǎn)物分離提取[5-6]等方法獲得。化學(xué)合成L-瓜氨酸的方法存在產(chǎn)品純度不夠和環(huán)境危害，應(yīng)用受到限制；發(fā)酵法生產(chǎn)的難點在于單位體積L-瓜氨酸產(chǎn)率低，最高僅為1.7 g/L，成本較高[7]；酶法合成L-瓜氨酸產(chǎn)物濃度高，但是轉(zhuǎn)化率較低，同時會產(chǎn)生雜酶, 影響瓜氨酸的生產(chǎn)；而天然產(chǎn)物中分離的L-瓜氨酸純度較好，具有綠色、無毒副作用等特點倍受青睞。西瓜、天花粉和栝樓根中含有L-瓜氨酸[8-9]，但受到原料來源有限和含量不高制約，生產(chǎn)規(guī)模較小。因此找到一種廣泛生長的富含L-瓜氨酸的植物也是一種很好的研究方向[2]。

目前，分析L-瓜氨酸的方法主要有阿氏法[10]、薄層色譜法[11]、酶法[12]、分光光度法[6,13]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-16]、氣相色譜-質(zhì)譜法[17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[18-19]等。由于L-瓜氨酸具有高的親水特性和弱的紫外吸收，大多數(shù)研究報道的分析方法均需要衍生，衍生過程較復(fù)雜，衍生試劑毒性較高。因此建立一種非衍生化分析檢測L-瓜氨酸的方法成為近年來研究方向之一。

籽瓜（又稱打瓜）是葫蘆科西瓜屬普通西瓜的栽培變種，一種極具地域特色的農(nóng)產(chǎn)品，籽瓜主要產(chǎn)于中國，新疆是中國籽瓜最大的產(chǎn)區(qū)。目前，對籽瓜的利用只有取籽加工，其余約占瓜質(zhì)量95%以上的部分都作為廢物而被丟棄[20]，造成極大的資源浪費。本實驗建立一種非衍生化的前處理LC-MS-MS法對籽瓜中L-瓜氨酸做了定性分析，以及HPLC方法快速簡便測定籽瓜中L-瓜氨酸含量，為籽瓜功能性成分研究和籽瓜資源的深加工提供了理論依據(jù)，也為植物源L-瓜氨酸的研究與應(yīng)用提供新的原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同籽瓜品種材料來源見表1；L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純） 霍尼韋爾貿(mào)易有限公司；磷酸、甲醇（均為分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠。實驗室用水均為高純水（≥18 MΩ·cm）。

表1 不同品種籽瓜材料Table 1 Different seeding watermelon cultivars

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有可變波長紫外檢測器、示差折光檢測器和EZChrom Elite工作站） 美國安捷倫公司；Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱北京迪馬科技有限公司；Quattro Premier LC-MS-MS聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源和MassLynx4.1軟件操作系統(tǒng)） 美國Waters公司；UV-2600紫外-可見分光光度計日本島津公司；DZG-303A“艾柯”實驗室專用超純水儀成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；Anke GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；IKA?A 11基本型研磨機 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SK720H型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將籽瓜清洗去籽，去表皮，分離瓜心、瓜瓤和瓜皮，冷凍，粉碎，保存在－80 ℃冰箱待用。稱取1.0 g籽瓜樣品，精確至0.01 g，置于50 mL離心管，加入40 mL提取劑（甲醇-1 mol/L鹽酸（9∶1，V/V））搖勻后，超聲提取30 min，加入8 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，用濾紙過濾，12 000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μm有機濾膜過濾，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.020 0 g L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶液溶解定容至100 mL，該儲備液質(zhì)量濃度為200 μg/mL，再依次配制成0.5、1.0、5.0、10、20、50、100 μg/mL一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜條件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：10%乙腈和90%甲醇溶液（甲醇-水（1∶1，V/V））；流速0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣流量50 L/h；干燥氣為氮氣，流量為650 L/h，碰撞氣體為氬氣，流量為0.18 mL/min；電噴霧離子源；正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（multi reaction monitoring mode，MRM）方式檢測。其他參數(shù)見表2。

表2 檢測L-瓜氨酸的質(zhì)譜條件Table 2 MS conditions for the detection of L-citrulline

1.3.4 HPLC分析條件

色譜柱：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.03 mmol/L磷酸；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：202 nm；進樣量20 μL。

1.3.5 提取條件優(yōu)化

提取條件單因素水平：提取劑 為a（甲醇-1 mol/L鹽酸（9∶1））、b（甲醇-1 mol/L鹽酸（18∶1））、c（乙醇-1 mol/L鹽酸（9∶1））、d（乙醇-1 mol/L 鹽酸（18∶1））、e（pH值為3的鹽酸溶液）、f（高純水）；料液比（g/mL）為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；提取時間為5、10、20、30、45、60 min（超聲時用溫度計實時監(jiān)測溫度，控制溫度變化小于5 ℃）。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜中L-瓜氨酸的鑒定

圖 11 L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和籽瓜樣品MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of L-citrulline in standard solution and seeding watermelon sample

對1 μg/mL L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行一級全掃描和子離子掃描，確定L-瓜氨酸的母離子和子離子，選擇兩個豐度較高、干擾較少的子離子作為定性離子和定量離子，其MRM色譜圖如圖1a所示。將籽瓜瓤樣品按樣品處理方法處理稀釋后，進樣10 μL，得到MRM色譜圖如圖1b所示?？梢钥闯鲎压蠘悠分心繕?biāo)物質(zhì)的峰與L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時間一致，選擇的特征離子的保留時間及豐度之比與標(biāo)準(zhǔn)品的一致，確定目標(biāo)物質(zhì)為L-瓜氨酸，該方法能夠用于籽瓜樣品中L-瓜氨酸的定性分析。在此基礎(chǔ)上，本實驗建立了一種快速簡便的HPLC方法檢測籽瓜中L-瓜氨酸的含量。

2.2 提取條件的優(yōu)化

以L-瓜氨酸的提取量為指標(biāo)，采用單因素試驗和正交試驗對提取條件進行了優(yōu)化。由于甲醇的沸點為64.5 ℃，提取溫度過高容易造成提取劑的損失，影響實驗結(jié)果，錢驊等[9]研究表明25 ℃時瓜氨酸提取率較高，提取一次即可提取完全。因此選擇考察提取劑、料液比和提取時間3 個參數(shù)。

圖2 提取劑對籽瓜中L-瓜氨酸含量的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on L-citrulline recovery from seeding watermelon

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化提取液中加入鹽酸是為了調(diào)節(jié)提取液pH值呈酸性，提取液pH值在L-瓜氨酸等電點（pH 5.97）時，溶解性最低，提取效果不好，呈酸性時水溶性增大，也避免了堿性條件下的糊化現(xiàn)象，提取效果較好[5]。如圖2所示，在相同酸性條件下，由于甲醇穿透細(xì)胞壁的能力比乙醇強，L-瓜氨酸的提取量：a高于c，b高于d；在無有機提取劑的條件下，鹽酸溶液提取量比高純水高，說明酸性條件下有利于提取L-瓜氨酸，本實驗選擇a作提取液。甲醇毒性大，宜用于分析測試過程中少量提取，在實際大量生產(chǎn)提取時，可選擇價格低廉、無毒的乙醇或者鹽酸溶液做提取溶劑。

2.2.2 料液比的優(yōu)化

圖3 料液比對籽瓜中L-瓜氨酸含量的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on L-citrulline recovery from seeding watermelon

由圖3可知，提取液使用量越大，L-瓜氨酸含量越高，在料液比為1∶40時，L-瓜氨酸的含量不再隨著提取液用量增大而提高，提取液濃度太低也會增加后續(xù)分離工作的負(fù)擔(dān)，故選擇料液比為1∶40提取。

2.2.3 提取時間的優(yōu)化

由圖4所示，提取時間低于30min時，L-瓜氨酸的提取量隨時間的延長又較明顯的提高，隨后呈下降趨勢，可能由于雜質(zhì)增多影響L-瓜氨酸的提取分離。

圖4 提取時間對籽瓜中L-瓜氨酸含量的影響Fig.4 Effect of extraction duration on L-citrulline recovery from seeding watermelon

2.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對提取劑、料液比和提取時間3 個因素設(shè)計L9（33）正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments and range analysis

由表3可知，影響籽瓜中L-瓜氨酸提取量主次因素為B＞C＞A，即提取劑為最主要因素，料液比和提取時間為次要因素。從各因素極差分析結(jié)果得出最佳提取條件為A2B1C2，正交試驗中4號試驗恰好是此條件的組合，故最優(yōu)提取條件為甲醇-1 mol/L鹽酸溶液（9∶1，V/V）作提取劑、料液比1∶40、提取時間30 min。

2.3 液相分離條件優(yōu)化

研究表明C18柱能分離西瓜中的L-瓜氨酸[14]，為了選擇適合分析籽瓜樣品的色譜柱，本實驗選用Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Anilent Technologies C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱進行分離實驗。實驗結(jié)果表明Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果較好。同時考察不同濃度的磷酸的分離效果，最終確定0.03 mmol/L磷酸作為流動相。通過紫外-可見分光光度計在190～400 nm掃描，優(yōu)化檢測波長為202 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品及籽瓜中L-瓜氨酸的色譜圖

將L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和籽瓜樣品提取液分別注入HPLC儀，色譜圖見圖5。可見L-瓜氨酸信號峰能與其他雜質(zhì)峰分離，此方法可用來分析籽瓜中的L-瓜氨酸。

圖 55 L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）和籽瓜樣品（B）HPLC色譜圖Fig.5 Chromatograms of L-citrulline standard (A) and seeding watermelon sample (B)

2.5 方法考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

外標(biāo)法以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積Y和其質(zhì)量濃度X/（μg/mL）作圖，如圖6所示，得回歸方程Y=183 581.261 76X+30 791.954 61，R2=0.999 9。將最小質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液無限稀釋，按照既定方法進樣測定空白和稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計算信噪比，3倍信噪比對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度確定的檢出限為0.02 μg/mL，10倍信噪比對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度確定的定量限為0.08 μg/mL。

圖6 6 L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard calibration curve of L-citrulline

2.5.2 方法精密度

表4 精密度實驗結(jié)果（n=5）Table 4 Results of precise tests (n = 5)

在HPLC色譜條件下，分別對10 μg/mL和50 μg/mL的L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進樣量20 μL，重復(fù)進樣5 次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.74%和0.31%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性實驗

精密稱取同一籽瓜樣品5 份，制備成供試樣品溶液，用HPLC分別測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.16%，表明該方法重復(fù)性較好。

表5 重復(fù)性實驗結(jié)果（n=5）Table 5 Results of repeatability tests（n=5）

2.5.4 加標(biāo)回收實驗

在黑豐1號籽瓜的瓜心、瓜瓤和瓜皮樣品中分別加入一定量外源標(biāo)準(zhǔn)L-瓜氨酸，然后按照樣品溶液測定步驟進行定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用峰面積計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表6。該方法回收率在95.12%～104.21%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.86%～4.75%之間，表明該方法能準(zhǔn)確測定籽瓜中L-瓜氨酸的含量。

表6 加標(biāo)回收實驗結(jié)果（n=3）Table 6 Results of recovery tests (n =3)

2.6 實際樣品分析

采用本實驗建立的HPLC方法對實際樣品進行測試。由表7可見，新疆主要種植的籽瓜品種果實中L-瓜氨酸平均含量在0.656～2.563 mg/g。不同品種間瓜氨酸含量差異明顯，其中SW6平均含量最高，達到2.563 mg/g，其次是SW1，含量為2.374 mg/g，含量最低的是SW3，只有0.656 mg/g。同品種的籽瓜種植在不同產(chǎn)區(qū)L-瓜氨酸含量存在差異，見SW1和SW2，SW4和SW5，存在差異的原因可能與氣候、土壤、人工管理等因素有關(guān)，有待進一步研究。對于同一個籽瓜而言，不同部位的L-瓜氨酸含量有所不同，SW1和SW2中L-瓜氨酸含量：瓜皮＞瓜瓤＞瓜心；SW3、SW5、SW6和SW7中L-瓜氨酸含量：瓜心＞瓜瓤＞瓜皮；而SW4則是瓜瓤＞瓜心＞瓜皮。

表7 不同籽瓜品種果實不同部位L-瓜氨酸含量（n=3）Tabllee 77 L-Citrulline contents in different parts of seedling watermelon from different varieties (n = 3) mg/g

3 結(jié) 論

本研究表明，籽瓜中含有豐富的L-瓜氨酸，LC-MSMS法可對籽瓜中的L-瓜氨酸進行準(zhǔn)確定性，HPLC法可以快速、靈敏檢測籽瓜中L-瓜氨酸的含量。本方法前處理步驟簡單、無需衍生、重復(fù)性好、回收率符合要求。通過對實際樣品的檢測，可知新疆主要種植的籽瓜品種果實中L-瓜氨酸平均含量在0.656～2.563mg/g，不同品種籽瓜中L-瓜氨酸含量存在差異，同一個籽瓜不同部位L-瓜氨酸含量有所不同，相同品種的籽瓜種植的地區(qū)不同也會影響L-瓜氨酸含量，存在含量差異的因素需要進一步研究。本實驗為籽瓜副產(chǎn)物的充分利用提供參考依據(jù)。

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Identification and Quantitation of L-Citrulline in Seeding Watermelon by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Rapid High Performance Liquid Chromatography

XI Dong-hua1, LI Wei-xia1, GAO Jing2, ATAWULLA?Tiemur3, LI Ling1, WU Bin3,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Center for Physics and Chemistry Analysis, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 3. Institute of Agro-Products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, ürümqi 830091, China)

In this work, certification of L-citrulline in seeding watermelon extract by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS), and rapid determination of underivatized L-citrulline in seeding watermelon by high performance liquid chromatography (HPLC) were established. Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the extraction conditions. LC-MS-MS analysis was carried out using Acuity C18(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) as the stationary phase and a mixture of 10% acetonitrile and 90% methanol-water (50:50, V/V) as the mobile phase at a fl ow rate of 0.2 mL/min with a column temperature of 40 ℃. The electrospray ionization (ESI) source was applied and operated in a positive ion mode. The diagnostic product ions of L-citrulline were m/z 176.09/158.9 and m/z 176.09/112.9. Moreover, the ion pair of m/z 176.09/158.9 was used for quantification. HPLC separation was performed suing Platisil ODS C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) as the stationary phase and 0.03 mmol/L phosphoric acid as the mobile phase at a fl ow rate of 0.7 mL/min with a column temperature of 30 ℃, and the detection wavelength was set at 202 nm. The results showed that a good linear relationship was obtained for L-citrulline in the concentration range of 0.5–100 μg/mL with R2= 0.999 9. Average recoveries varied from 95.12% to 104.21% with RSD of 1.86%–4.75% (n = 3). The content of L-citrulline in seeding watermelon was determined to be 0.656–2.563 mg/g.

seeding watermelon; L-citrulline; non-derivatization; liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630（2014）24-0271-06

10.7506/spkx1002-6630-201424052

2014-03-21

新疆維吾爾自治區(qū)級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（KY2013045；KY2014038）

席冬華（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物的分析。E-mail：553764469@qq.com

*通信作者：吳斌（1973—），男，副研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：xjuwubin0320@sina.com