曾維勇，丁文婷，邱 敏，劉 微

缺血性腦血管疾病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是對(duì)人體健康具有嚴(yán)重危害性的多發(fā)病與常見(jiàn)病。ICVD 的損傷機(jī)制涉及到興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等。其中，位于星型膠質(zhì)細(xì)胞膜上的縫隙連接(gap junction，GJ)是細(xì)胞間物質(zhì)與信息傳遞的通路，在腦缺血中半暗帶(ischemic penumbra，IP)向梗死灶的發(fā)展過(guò)程中有雙向作用［1～3］，但其雙向作用機(jī)制尚不明確。

有研究指出，縫隙連接抑制劑辛醇對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷存在雙向作用，且可能與腦缺血時(shí)間有關(guān)［4，5］。制作局灶性腦缺血再灌注模型前給予辛醇抑制縫隙連接，通過(guò)檢測(cè)不同程度腦缺血腦組織中過(guò)氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)的含量，來(lái)探討論證縫隙連接抑制劑辛醇在腦缺血中的雙向作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD 大鼠80 只，體重180～220g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK(粵)20130020。動(dòng)物飼料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。辛醇(購(gòu)自美國(guó)SIGMA-ALDRICH 公司)，溶于0.5%的二甲基亞砜(DMSO)(購(gòu)自美國(guó)AMRESCO 公司)溶液。SOD、MDA 及蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)、低溫離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、紫外分光光度計(jì)(Biochrom Ltd)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 SD 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、同一時(shí)間點(diǎn)的模型組和辛醇組，每組16 只。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［4，5］，在缺血后30 min 及2 h 再灌注損傷明顯不同，所以選擇這2 個(gè)缺血時(shí)間，即30 min 和2 h 進(jìn)行辛醇干預(yù)。

1.2.2 給藥及制備模型 辛醇組于缺血前30 min 按5 mmol/kg 的劑量腹腔給藥。腦缺血模型組予以等量的DMSO溶液替代。采用改良的Longa 線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，并在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，右側(cè)頸總動(dòng)脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.26 mm 的尼龍魚(yú)線，進(jìn)線長(zhǎng)度18 mm～19 mm，缺血相應(yīng)時(shí)間(30 min/2 h)拔出線栓。剔除實(shí)驗(yàn)期間死亡及模型不成功的大鼠，并及時(shí)予以補(bǔ)充。再灌注24 h 后，腹腔麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，用冰冷生理鹽水漂洗干凈后，除去軟腦膜，取缺血大腦半球約300 mg的額、頂葉腦皮質(zhì)(電子天平稱重)，-80 ℃冰箱中冷藏待用。

1.2.3 腦組織勻漿生化指標(biāo)檢測(cè) 將腦組織加入9 倍于樣品重量的生理鹽水，在冰水浴中勻漿制成10%(W/V)的組織勻漿液。置于低溫離心機(jī)中，以3500 r/min 的轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心10 min。取上清液，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定腦組織勻漿中的蛋白濃度、MDA 和SOD 含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 for Windows 軟件包統(tǒng)計(jì)，各組資料結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA 含量的比較 同假手術(shù)組相比，缺血30 min和2 h 的模型組腦缺血組織中的MDA 含量均明顯升高(P＜0.05)，而且2 h 模型組比30 min 模型組含量更高。缺血30 min 的辛醇組，大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯高于30 min 模型組(P＜0.05)。然而，缺血2 h 的辛醇組大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯低于2 h 模型組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 辛醇對(duì)大鼠腦組織勻漿中MDA 和SOD 含量的影響

2.2 各組SOD 含量的比較 同假手術(shù)組相比，缺血30 min和2 h 的模型組腦缺血組織中的SOD 含量均明顯降低(P＜0.05)，而且2 h 模型組比30 min 模型組含量更低。缺血30 min 的辛醇組，大鼠腦缺血組織中的SOD 含量顯著低于30 min 模型組(P＜0.05)。與此相反的是，缺血2 h 的辛醇組大鼠腦缺血組織中的MDA 含量明顯高于2 h 模型組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

3 討論

目前腦缺血的治療主要包括兩個(gè)方面:一方面是改善和恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，促進(jìn)微循環(huán);另一方面是使用腦細(xì)胞保護(hù)劑進(jìn)行綜合治療，包括鈣離子通道阻滯劑、自由基清除劑和興奮性氨基酸拮抗劑等。然而，目前這些治療方法的效果不是很理想。近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床動(dòng)態(tài)觀察表明，腦缺血的損傷是進(jìn)行性的，缺血中心區(qū)細(xì)胞先發(fā)生死亡，繼而位于缺血中心區(qū)周?chē)?、血供相?duì)減少的區(qū)域半暗帶的細(xì)胞逐漸失去活性，梗死范圍擴(kuò)大。但是如果及時(shí)給予適當(dāng)?shù)闹委熗炀冗@些細(xì)胞，就會(huì)減小梗死體積改善預(yù)后。因此拯救位于半暗帶的神經(jīng)元成為治療腦缺血的關(guān)鍵［6，7］。大量實(shí)驗(yàn)表明半暗帶神經(jīng)元的死亡不是局部血流量的減少或缺失直接造成的，它屬于繼發(fā)性損傷:缺血區(qū)域的擴(kuò)散性神經(jīng)電活動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)鈣超載、過(guò)量的興奮性氨基酸和自由基，最終造成細(xì)胞膜的破壞和神經(jīng)元的死亡，使半暗帶轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘該p傷的腦組織。

星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)提供葡萄糖、重吸收谷氨酸、釋放營(yíng)養(yǎng)因子等對(duì)神經(jīng)元起著重要的支持作用［8］。位于其細(xì)胞膜上的縫隙連接是星形膠質(zhì)細(xì)胞中最具有特色的結(jié)構(gòu)，由大量連接小體(主要是connexin 43)有規(guī)律排列構(gòu)成。它允許直徑＜1.5 nm 的小分子物質(zhì)通過(guò)，為細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞提供了直接通路［1］。有研究表明縫隙連接抑制劑辛醇可擴(kuò)大腦缺血30 min 的梗死體積并加重其神經(jīng)元損傷，卻減少腦缺血2 h 的腦梗死體積并減輕其神經(jīng)元損傷［4，5］。MDA 是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。細(xì)胞受到氧自由基攻擊從而引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量MDA 損傷細(xì)胞膜進(jìn)而使細(xì)胞死亡［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到30 min 模型組大鼠的MDA 含量低于30 min辛醇組，而2 h 模型組大鼠的MDA 含量高于2 h 辛醇組。故推測(cè)腦缺血30 min 后MDA 濃度較低，通過(guò)縫隙連接的引導(dǎo)擴(kuò)散可降低其對(duì)腦組織的損傷;而腦缺血2 h 后MDA的濃度過(guò)高，通過(guò)縫隙連接的擴(kuò)散則加大對(duì)腦組織的損傷。

SOD 則是細(xì)胞的抗氧化酶促防御系統(tǒng)，當(dāng)體內(nèi)自由基生成增多時(shí)，SOD 可清除超氧陰離子，從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害［10］，故SOD 反映了細(xì)胞的自我保護(hù)能力。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到30 min 模型組大鼠的SOD 含量高于30 min辛醇組，而2 h 模型組大鼠的SOD 含量低于2 h 辛醇組。推測(cè)在腦缺血30 min 后，較多的SOD 通過(guò)縫隙連接的擴(kuò)散可降低腦組織損傷;而腦缺血2 h 后，SOD 的濃度相對(duì)不足很難通過(guò)擴(kuò)散對(duì)腦組織進(jìn)行有效地保護(hù)，故組織損傷加重。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，縫隙連接抑制劑辛醇對(duì)不同缺血時(shí)間的雙向作用可能與MDA 和SOD 有關(guān)，初步論證了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)縫隙連接在腦缺血中的作用與腦缺血的損傷程度有關(guān)的推測(cè)［11，12］:如果損傷程度輕，通過(guò)縫隙連接引導(dǎo)的有害物質(zhì)擴(kuò)散使得損傷性分子的濃度下降，緩沖了它們對(duì)神經(jīng)元的毒性作用占據(jù)主要地位，從而起到保護(hù)作用;反之如果腦缺血很?chē)?yán)重，損傷性分子的濃度升高，通過(guò)縫隙連接引導(dǎo)的擴(kuò)散會(huì)損傷到星形膠質(zhì)細(xì)胞自身(bystander death)，清除損傷性分子的能力大大下降，從而增加腦缺血的損傷區(qū)域。

［1］Farahani R，Pina-Benabou MH，Kyrozis A，et al.Alterations in metabolism and gap junction expression may determine the role of astrocytes as“good samaritans”or executioners［J］.Glia，2005，50(4):351-361.

［2］Lin JH，Lou N，Kang N，et al.A central role of connexin 43 in hypoxic preconditioning［J］.J Neurosci，2008，28(3):681-695.

［3］牛曉珊，瑪依努爾買(mǎi)買(mǎi)提，黨 輝，等.縫隙連接蛋白-43 阻斷劑辛醇對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29(5):409-411.

［4］Ding W，Zhou L，Liu W，et al.Opposite effects of the gap junction blocker octanol on focal cerebral ischemia occluded for different durations［J］.Mol Med Rep，2014，9(6):2485-2490.

［5］劉 微，丁文婷，關(guān) 莉，等.縫隙連接抑制劑辛醇對(duì)腦缺血不同時(shí)間再灌注大鼠腦梗死體積和神經(jīng)元損傷的影響［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2013，26(5):355-357.

［6］Katsuta K，Umemura K，Ueyama N，et al.Pharmacological evidence for correlation between hippocampal CA1cell damage and hyperlocomotion following global cerebral ischemia in gerbils［J］.Eur J Pharmacol，2003，467(1):103-109.

［7］Liu S，Levine SR，Winn HR.Targeting ischemic penumbra:part I from pathophysiology to therapeutic strategy［J］.J Exp Stroke Transl Med，2010，3(1):47-55.

［8］Rossi DJ，Brady JD，Mohr C.Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia［J］.Nature neurosci，2007，10(11):1377-1386.

［9］Jarasch ED，Bruder G，Hei HV，et al.Singificance of xanthine oxidase in capillary endothialcell［J］.Acta Pysiol Scand Suppl，1986，548:39-46.

［10］Blech DM，Borders CL.Hydroperoxide anion，Ho-2，is an affinity reagent for the inactivation of yeast c/z superoxide dismutase modification of one histidene persubunit［J］.Arch Biochem Biophys，1983，224(2):579-586.

［11］Contreras JE，Sanchez HA，Veliz LP，et al.Role of connexin-based gap junction channels and hemichannels in ischemia-induced cell death in nervous tissue［J］.Brain Res Brain Res Rev，2004，47(1):290-303.

［12］Perez Velazquez JL，F(xiàn)rantseva MV，Naus CC.Gap Junctions and Neuronal Injury:protectants or executioners［J］.Neuroscientist，2003，9(1):5-9.