王 騰，靳 換，紀麗麗，張清水，韓相敏，孫海港，白如念，楊秀環(huán)，何偉勇，蘇敬良

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物流行病學與人畜共患病重點實驗室，北京 海淀100193；2.北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京 朝陽100107）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）是一種兼性厭氧的革蘭陽性小桿菌，作為多種家養(yǎng)和野生動物的病原菌或共生菌廣泛存在于自然界，包括海洋環(huán)境中，與扁桃體丹毒絲菌（E.tonsillarum）和E.inopinata共同構成丹毒絲菌屬[1]。根據(jù)目前的血清學分型方法，采用瓊脂擴散試驗可將該屬成員可分為至少23個血清型（serovar 1-23）及N型株，其中豬丹毒絲菌包括血清型1a、1b、2、4、5、6、8、9、11、12、15、16、17、19、21型和N型；扁桃體丹毒絲菌包括血清型3、7、10、14、20、22型和23型；血清型13和18則可能屬于E.inopinata[2-4]。在所有的丹毒絲菌中，其中以豬丹毒的流行范圍最廣，并造成巨大的經(jīng)濟損失。豬丹毒絲菌血清1、2型在豬群中分離率最高（占75%～80%）。近年來，家禽丹毒絲菌感染已有過不少的報道，其中以火雞感染造成的損失最為嚴重。各日齡的火雞均易感，感染后主要表現(xiàn)為虛弱、精神沉郁、腹瀉和猝死，產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降[5]。

本研究先后對兩個出現(xiàn)產(chǎn)蛋異常的鴨群進行診斷，從送檢鴨腦組織中分離到2株細菌，經(jīng)過對分離株的16S rRNA基因序列分析鑒定為豬丹毒絲菌，并通過小鼠感染試驗對分離株的毒力進行了檢測，同時，采用生長凝集試驗對3個不同鴨場的種鴨血清樣本進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 病例概況 病例1為60周齡北京鴨父母代種群，臨床表現(xiàn)為死淘率偏高，日均死亡率為0.2%～0.3%，飲水應用多種抗生素未能降低死亡率，送檢4只，剖檢主要表現(xiàn)為肝臟輕度腫大、質(zhì)脆，個別鴨脾臟腫大，其他臟器無明顯的肉眼病變。

病例2為40周齡北京鴨父母代種群，鴨群外表正常，但產(chǎn)蛋最高峰始終維持在84%左右。送檢3只死淘鴨，剖檢無明顯的肉眼病變。

1.2 病原分離和鑒定

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 取腦、肝臟組織分別接種于添加2%小牛血清的胰酶大豆瓊脂平板（TSA，BD公司），于燭缸37℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。待細菌生長后，挑取可疑菌落劃線接種于TSA平板，于燭缸37℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)過傳代純化培養(yǎng)后對分離細菌進行革蘭染色和鏡檢。

1.2.2 16S rRNA基因擴增及序列分析 挑選單個菌落接種于10mL添加1%小牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，BD公司）中，37℃搖振培養(yǎng)18 h。離心收獲細菌，采用StarPrep Bacterial DNA Kit（北京全式金生物技術有限公司）提取細菌基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

利用細菌16S rRNA保守區(qū)通用引物[6]，以細菌的DNA為模板進行擴增。PCR反應體系（25μL）為：Taq Mix（Genstar）12.5μL，DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，加滅菌雙蒸餾水至25μL。PCR擴增條件為：95℃，5 min；95℃40 s，54℃40 s，72℃50 s，30個循環(huán)；72℃10min。反應結束后，取5μL PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢查。剩余20μL產(chǎn)物經(jīng)純化后送北京三博遠志生物技術有限責任公司進行核酸序列測定。獲得的序列結果應用DNAStar軟件進行分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rRNA基因序列進行比較，確定細菌種屬。

1.2.3 多重PCR檢測spa基因 根據(jù)Shen等的報道[11]，合成針對丹毒絲菌的spa A、spa B和spa C基因的特異性引物（見表1），采用多重PCR方法擴增spa基因。多重PCR 20μL反應體系：10μLPCRMix（Gene star），上、下游引物各0.5μL（10μmol/L），模板DNA 1μL，加水至20μL。PCR的反應條件為：95℃，5min；95℃，40 s，55℃，40 s，72℃，1min，30個循環(huán)；之后72℃延伸7min。反應結束后，取5μLPCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢查。

表1 spa基因PCR擴增引物序列

1.2.4 細菌藥物敏感性檢測 將細菌接種于TSB培養(yǎng)基，于37℃搖振培養(yǎng)過夜，之后將菌液濃度調(diào)整至108CFU/mL，均勻涂布于TSA平板上，然后放置不同藥敏紙片（購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司）,37℃培養(yǎng)18 h后讀取結果。

1.2.5 病毒分離 為了檢查鴨群是否發(fā)生病毒性感染，在進行細菌培養(yǎng)的同時，取肝臟、脾臟和腦組織混合后，加滅菌緩沖液制成20%懸液，研磨并凍融2次后，用孔徑0.22μm濾器過濾除菌，經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚9日齡鴨胚（0.3 mL/枚），37℃孵育觀察5 d，收集鴨胚尿囊液盲傳2代。

1.3 細菌毒力檢測 取6周齡雌性BALB/c小鼠45只，分成9組。從9組中隨機選出1組作為陰性對照組，余下8組分別接種2個分離株。菌液的稀釋度分別為10-2、10-3、10-4和10-5，經(jīng)腹腔注射0.2 mL/只，對照組注射0.2 mL PBS，觀察8 d并記錄小鼠臨床表現(xiàn)和死亡情況。同時將接種的菌液用無菌PBS作10倍系列稀釋，涂布于TSA平板，37℃過夜培養(yǎng)，計算活菌含量。

1.4 鴨血清抗體檢測 利用分離株B作為抗原，參照Y.Shimazaki等報道的生長抑制凝集試驗方法進行[8]。具體試驗方法如下：（1）預先將96孔V型板在75%酒精中浸泡4 h，并在用前將其靜置與超凈工作臺中紫外照射30min左右，風干；（2）在96孔V型板上，每孔加80μL TSB培養(yǎng)基（pH值7.6含有0.1%Tween-80，25μg/mL慶大霉素，250μg/mL卡那霉素），在第1孔中加待檢血清100μL，之后做2倍系列稀釋。每板中選2孔以SPF雞血清、無丹毒絲菌感染雛鴨血清為陰性對照；（3）將TSB液體培養(yǎng)的細菌作為抗原加到V型板中，每孔5μL；4）將96孔V型板放置在無菌的大平皿中，同時于平皿中加一滅菌水浸泡過的無菌紗布以保持平皿內(nèi)部的濕潤，37℃作用24 h。結果判定：若血清樣本中有抗體存在，在V型孔底部則出現(xiàn)菌體凝集、上清澄清，且傾斜V型板不流動；若為陰性，則培養(yǎng)液渾濁底部有菌體沉淀，無凝集，傾斜V型板可見菌體沉淀流動；如抗體效價達到或者高于1∶16，即判斷為豬丹毒絲菌抗體陽性。

2 結果

2.1 細菌分離及培養(yǎng)特性 組織樣本經(jīng)無菌處理后接種鴨胚并盲傳2代均未引起胚體死亡或出現(xiàn)肉眼病變。尿囊液血凝檢測為陰性，初步排除病毒感染。

從2個鴨場送檢的鴨腦組織中分離到2株細菌，分別命名為Ery-BJa株和Ery-BJb株。分離菌在加血清的TSA平板上生長良好，菌落透明、表面光滑、微凹、圓形、邊緣整齊露珠狀小菌落。將在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的細菌涂片進行革蘭染色，結果2株細菌均為革蘭陽性，但在形態(tài)上兩株細菌存在較大差異，其中Ery-BJa株菌絲較長，菌絲中存在部分著色不均現(xiàn)象，而Ery-BJb株菌則較為短小，僅個別菌體較長。

2.2 16S rRNA基因鑒定 利用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，獲得預期片段大小約為750 bp(圖1)，核酸序列分析結果顯示2個分離株與已知的豬丹毒絲菌的同源性高達100%，判定為豬丹毒絲菌。

圖1 豬丹毒絲菌分離株16S rRNA基因PCR擴增結果

2.3 spa基因多重PCR檢測 為了確定分離株的spa基因型，采用多重PCR對兩株細菌進行了檢測，結果Ery-BJa株擴增出大小約1 000 bp的片段，與報道的spa C型一致；Ery-BJb株的片段大小約900 bp，與spa B型一致（圖2）。

圖2多重PCR對豬丹毒絲菌分離株spa基因分型結果

2.4 細菌對小鼠的致病力 小鼠接種Ery-BJa菌后各組在感染后第2天未表現(xiàn)明顯的前驅(qū)癥狀即出現(xiàn)急性死亡高峰，根據(jù)Reed-Muench法計算A株的LD50為103CFU/0.2mL。Ery-BJb菌在接種后第4天和第5天出現(xiàn)死亡高峰，LD50≤102CFU/0.2mL。

2.5 藥敏試驗結果 紙片法進行體外藥敏試驗表明，此次分離菌株對慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、大觀霉素、紅霉素、萬古霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐及頭孢噻肟耐藥；對青霉素G、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢噻吩敏感。

2.6 鴨群抗體水平測定 采用生長凝集試驗對3個種鴨場血清抗丹毒絲菌抗體水平檢測結果顯示，A場50份血清中，41份（82%）抗體水平可判為陽性（≥1∶16）。B場20份血清中，4份抗體水平可判為陽性。C場20份血清中，7份抗體水平可判為陽性?？贵w水平具體分布見圖3。

圖3 A、B和C三個種鴨場鴨血清抗豬丹毒絲菌抗體水平分布

3 討論

本研究從北京地區(qū)2個出現(xiàn)生產(chǎn)性能異常的種鴨群分離到2株豬丹毒絲菌，并通過血清學檢測證明鴨群中均存在丹毒絲菌抗體陽性個體，表明種鴨群存在不同程度的豬丹毒絲菌感染。

據(jù)報道，豬丹毒絲菌不僅可造成雛火雞和雛鴨死亡，也可引起雄禽的授精能力下降和感染雞群產(chǎn)蛋下降[5]。Eriksson等報道，瑞典一蛋雞場發(fā)生丹毒絲菌感染引起死亡和產(chǎn)蛋下降，6 030只雞從60周齡到66周齡之間死亡1 861只[9]。Nakazawa曾報道幾乎所有的雞群均有丹毒絲菌污染[10]。Kurian等對新西蘭雞群進行血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，55個雞群中有46個為陽性（83%），檢查的545份血清的陽性率為39.8%，其中12周齡以上的陽性率明顯高于12周齡以內(nèi)的雞[11]。鴨和鵝自然感染也可引起嚴重的經(jīng)濟損失。Dhillon等報道過美國一鴨場北京鴨發(fā)生丹毒絲菌感染，2 000只的雛鴨群在15～21日齡死亡約700只，同時一個2 400只鴨的種鴨群每天的死亡率為4%～5%。剖檢變化為肝臟腫大、質(zhì)脆，漿膜下層有針尖狀出血點[12]。劉文華等從送檢的鴨肝臟組織中也分離到丹毒絲菌[13]，但有關種鴨丹毒絲菌感染的流行病學以及丹毒絲菌感染所造成的危害尚不完全清楚。本研究采用生長抑制凝集試驗對3個鴨群的調(diào)查，結果血清學抗體陽性率分別為20%至82%，表明我國種鴨群存在不同程度的感染，與國外報道的雞群中血清抗體陽性率相近。其中，A場陽性率最高，B、C相對較低。所分離到的丹毒絲菌Ery-BJb株即從A場患病鴨群中分離得到，由此分析本場鴨群可能普遍感染過丹毒絲菌，但大部分個體呈耐過，而抗體水平在血清采集時依舊處于較高水平。B、C兩場并未分離到丹毒絲菌，也未發(fā)現(xiàn)有相關癥狀個體出現(xiàn)。

丹毒絲菌的表面保護性抗原（surface protective antigen，spa）具有高度的免疫原性和保護原性。已報道的丹毒絲菌有3種spa型，即spa A、spa B和spa C，其中spa A主要存在于血清型1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17和N，spa B主要存在于血清型4、6、11、19和21，而spa C則主要存在于丹毒絲菌2株（E.sp.strain 2）血清型18種。同型spa蛋白的氨基酸高度同源，對同一spa型細菌感染具有完全的保護作用，但對異型的交叉保護作用相對較低。因為spa抗原是丹毒絲菌目前研究最為清楚的具有保護原性表面蛋白，所以鑒定細菌的spa型對確定的細菌的致病性和免疫原性具有重要的意義。采用多重PCR對2個分離株進行spa基因分型結果表明分別屬于spa C型和spa B型，而國外報道的豬源分離株通常擁有spa A共同抗原，預示種鴨源菌株可能與豬群的流行株不同。因此，丹毒絲菌感染對商品鴨群的危害有待于進一步研究。

此外，豬丹毒絲菌作為一種人畜共患病病原，人類感染主要表現(xiàn)為局部皮膚感染、類丹毒（一種全身性皮膚感染）和與心內(nèi)膜炎相關的敗血癥等3種病型，主要與所從事的職業(yè)有關，通常是接觸被污染的動物、動物性產(chǎn)品及排泄物而感染。最易被感染的人群有屠宰人員、獸醫(yī)、農(nóng)民、漁民等通過皮膚傷口感染[4]。因此該菌對公共衛(wèi)生安全也構成一定的威脅，應引起高度重視。

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