杜國浩，李華濤，李守軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

犬的血型在1910年第一次被發(fā)現(xiàn)[1]。犬和人一樣有很多種血型，現(xiàn)在國際上公認(rèn)的有8種血型，這些血型分別命名為犬紅細(xì)胞抗原1（DEA 1）、DEA 3、DEA 4等[2]。其中DEA 1有4個(gè)亞型：1.1、1.2、1.3和陰性[3]。學(xué)者認(rèn)為DEA1血型為等位基因決定，DEA 1.1、1.2、1.3和陰性不會在犬上同時(shí)出現(xiàn)[4]。DEA1.1是在犬中最常見也是最重要的血型，有研究用蛋白質(zhì)印跡方法檢測出DEA1.1為兩個(gè)膜蛋白，大小分別為50 kD和200 kD[5]。犬不含DEA1血型的天然抗體，首次輸血不會因血型不符發(fā)生嚴(yán)重的輸血反應(yīng)，但再次輸血時(shí)，犬因血型錯(cuò)配會發(fā)生輸血反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至致命，其中DEA 1.1的輸血反應(yīng)最迅速也最劇烈[6-7]。因此，在輸血時(shí)應(yīng)特別注意DEA1.1血型是否相配，DEA 1.1陽性受血犬可接受DEA 1.1陽性或陰性血液，DEA 1.1陰性受血犬可接受DEA 1.1陰性血液。

美國、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家已有動物血庫，是以中央血庫的形式建立，并且有相應(yīng)完善的血型檢測程序。國內(nèi)沒有相應(yīng)的動物血庫，在獸醫(yī)臨床上輸血也很少測血型，只是臨時(shí)找供血犬，輸血前進(jìn)行簡單的交叉配血試驗(yàn)，少數(shù)測血型也是依靠國外進(jìn)口檢測試紙或者抗體，但進(jìn)口試紙與抗體價(jià)值不菲，給國內(nèi)獸醫(yī)臨床的輸血治療造成了巨大的阻力。本研究旨在制備DEA1.1血型多克隆抗血清，用于獸醫(yī)臨床寵物犬輸血前DEA1.1血型鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 QuickVet?/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test，DEA 1.1，DEA3，DEA 4、DEA 7多抗，購自加利福尼亞國際動物血液資源庫；EDTANA2，抗犬IgG抗體，購自奧博森公司，木瓜蛋白酶，酶標(biāo)抗犬IgG二抗，pH 7.2 PBS。

血型檢測及判定方法：嚴(yán)格按照快速檢測卡說明書操作：抽取全血直接檢測，結(jié)果與陰陽性對照比對。

抗球蛋白試驗(yàn)法：2%紅細(xì)胞懸液與1∶200多抗100μL等體積混勻，放37℃溫箱中30min，再用pH 7.2 PBS洗滌兩次，離心棄上清，加1∶200抗犬IgG抗體100μL混勻，在37℃溫箱靜置30min，觀察結(jié)果。

酶處理法：2%木瓜蛋白酶的PBS與壓積紅細(xì)胞2∶1的比例混勻，放置37℃溫箱孵育30min，3 000 r/min離心5min，棄上清，加PBS洗滌，反復(fù)3次，取處理的壓積紅細(xì)胞與PBS配置成2%紅細(xì)胞懸液，用1∶200多抗與懸液100μL等體積混勻，37℃溫箱中靜置30min，觀察結(jié)果。

血凝試驗(yàn)均用2 mL U型EP管進(jìn)行，管底有塊狀沉淀著為凝集，均勻狀態(tài)者為不凝集，斜放觀察凝集為固定狀態(tài)，不凝集為流淌狀態(tài)。

1.2 試驗(yàn)動物及樣本采集 經(jīng)DEA1.1血型鑒定為強(qiáng)陽性本地犬提供紅細(xì)胞血型抗原，陰性的比格犬作為制備多抗的試驗(yàn)犬。分別采集廣東本地犬30只，試驗(yàn)用比格犬10只，多個(gè)品種寵物犬20只和藏獒犬8只抗凝血樣本。血液樣本3 000 r/min離心5 min，棄上清與白細(xì)胞層，加PBS洗滌3次，用PBS配置成2%紅細(xì)胞懸液，用于制備多抗符合率檢測。

1.3 多抗的制備

1.3.1 抗原制備與試驗(yàn)動物的選擇 用血型檢測卡檢測篩選DEA1.1陰陽性犬用于試驗(yàn)，并檢測DEA1.1，DEA3，DEA 4和DEA 7，排除其他血型干擾。無菌分離陽性血型犬紅細(xì)胞，pH 7.2 PBS制備成50%紅細(xì)胞懸液，作為抗原，陰性血型比格犬作為被免疫動物。

1.3.2 免疫程序 初免經(jīng)靜脈、腹腔分別注射3mL抗原。14 d后二次免疫，抗原量同首免相同。以后每隔7 d用2mL抗原加強(qiáng)免疫，共免疫5次，最后1次免疫7 d后采血分離血清。

1.4 多抗的鑒定

1.4.1 陰陽性紅細(xì)胞鑒定 自制多抗用PBS稀釋100倍，分別用2%的DEA1.1陰陽性紅細(xì)胞做抗球蛋白試驗(yàn)，觀察血凝結(jié)果。

1.4.2 血凝效價(jià)鑒定 自制多抗用PBS稀釋從100～2 000倍，間隔100倍，用2%的DEA1.1陽性紅細(xì)胞做抗球蛋白試驗(yàn)，觀察結(jié)果，記錄血凝效價(jià)。

1.4.3 符合率統(tǒng)計(jì) 分別用200倍稀釋的進(jìn)口DEA1.1多抗和自制多抗對采來的68只犬的紅細(xì)胞進(jìn)行血型鑒定，兩組結(jié)果進(jìn)行比對，得出自制多抗與進(jìn)口多抗鑒定效果。

2 結(jié)果

2.1 抗原的確定 用快速檢測卡鑒定到并用于試驗(yàn)的1只DEA 1.1陽性廣東本地犬和1只DEA 1.1陰性比格犬，如圖1，2。并用DEA 1.1，DEA3，DEA 4，DEA 7多抗對兩只犬的紅細(xì)胞分別進(jìn)行抗球蛋白試驗(yàn)，結(jié)果顯示DEA 1.1分別為陽性和陰性，其余血型除DEA4為陽性外，均為陰性，證明了進(jìn)口多抗的有效性，并排除了其他血型的干擾。

圖1 DEA 1.1陰性犬血型

圖2 DEA 1.1陽性犬血型

2.2 多抗鑒定

2.2.1 抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果 DEA 1.1陽性紅細(xì)胞陽性，DEA 1.1陰性紅細(xì)胞陰性。

本研究所制多抗與進(jìn)口多抗符合率達(dá)98%。如表1。血凝效價(jià)試驗(yàn)，鑒定結(jié)果顯示，血凝效價(jià)為1 800倍，約為211。

2.2.2 酶處理試驗(yàn)結(jié)果 DEA 1.1陽性紅細(xì)胞陽性，DEA 1.1陰性紅細(xì)胞陽性。

采集的68份臨床樣本全部都是陽性。

3 討論

傳統(tǒng)的多抗制備方法[8]，運(yùn)用原核表達(dá)或多肽合成法獲取抗原。本研究在抗原未知且不能純化的情況下，用DEA 1.1陽性紅細(xì)胞作為血型抗原，免疫同種DEA 1.1陰性犬，排除異種之間產(chǎn)生非特異抗體的可能。本研究用DEA 1.1進(jìn)口多抗與自制多抗效果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)在廣東地區(qū)68只犬中只有1只本地土狗結(jié)果不符合，并且這1只犬紅細(xì)胞用自制多抗檢測為陰性，而進(jìn)口多抗檢測為陽性，這有可能因?yàn)樽灾频亩嗫贡冗M(jìn)口多抗對于DEA1.1抗原更加特異?？骨虻鞍自囼?yàn)顯示自制多抗與進(jìn)口多抗的符合率高達(dá)98%。說明按照我們的方法制備的DEA1.1血型多克隆抗血清完全可以滿足臨床犬輸血前血型鑒定的要求，并且可以用于臨床輸血前的血型鑒定。

表1 DEA1.1血型符合率統(tǒng)計(jì)情況

有研究表明[9]，在某些病人的血清中存在某些抗體能凝集木瓜蛋白酶處理過的紅細(xì)胞，稱為唯酶抗體，該類抗體可凝集自身紅細(xì)胞，同型紅細(xì)胞及所有陰性紅細(xì)胞，致使酶處理過的紅細(xì)胞血型檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究制作的多克隆抗體能與所有木瓜蛋白酶處理過的紅細(xì)胞反應(yīng)。說明所制備的多克隆抗血清中含有唯酶抗體，原因未知。但是唯酶抗體僅僅對經(jīng)過酶處理的紅細(xì)胞有反應(yīng)，并不影響抗球蛋白試驗(yàn)的結(jié)果，本研究制備的多抗可以有效的鑒定DEA1.1血型，但是需要注意的是不能鑒定用木瓜酶處理過的紅細(xì)胞。

本研究中調(diào)查顯示，廣東地區(qū)各品種犬的DEA 1.1血型陽性率有很大差異。值得注意的是廣東本地犬的DEA1.1陽性率高達(dá)83%，高于其他純種寵物犬。在國內(nèi)獸醫(yī)臨床輸血中，多用本地的大中型本地犬為供血犬，這給臨床輸血治療帶來很大的風(fēng)險(xiǎn)。本研究還是首次對國內(nèi)廣東地區(qū)本地犬的血型頻率進(jìn)行調(diào)查，對于廣東本地犬的臨床輸血有很大的指導(dǎo)意義。

本研究成功制備了DEA 1.1血型多克隆抗體，經(jīng)符合率比對后確定有效，并具有高血凝效價(jià)。DEA 1.1多克隆抗體的制備為國內(nèi)犬血型檢測提供了保障，為DEA 1.1血型單克隆抗體的制備及進(jìn)一步研究DEA 1.1抗原結(jié)構(gòu)打下了良好的基礎(chǔ)。

[1] Swisher S N，Young L E.The blood grouping systems of dogs[J].Physiol Rev，1961，41：495-520.

[2] Vriesendorp H M，Albert E D，Templeton JW，et al.Joint report of the second international workshop on canine immunogenetics[J].Transplant Proc，1976，8：289-314.

[3] Symons M，Bell K.Expansion of the canine A blood group system[J].Anim Genet，1991，22：227-235.

[4]Stormont C.A note on linear subtyping relationships.Papers dedicated to Johannes Moustgaard on the occasion of his 70th birthday，26 September 1981[J].Copenhagen：Royal Danish Agricultural Society，1981，190-193.

[5]Andrews G A，Chavey P S，Smith J E.Production,characterization,and applications of a murine monoclonal antibody to dog erythrocyte antigen 1.1[J].J Am Vet Med Assoc，1992，201：1549-1552.

[6]Giger U，Gelens C J，Callan M B，et al.A.An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocytic antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog[J].JAm Vet Med Assoc，1995，206：1358-1362.

[7]Young L E，Ervin D M，Yuile C L.Hemolytic reactions produced in dogs by transfusion of incompatible dog blood and plasma.1.Serologic and hematologic aspects[J].Blood，1949，4：1218-1231.

[8]賈慧娜，羅海玲.多克隆抗體制備方法的研究進(jìn)展[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)羊?qū)W分會2012年全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會議論文集[C].橫山：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)羊?qū)W分會，2012：66-69.

[9]馬曙軒，劉景漢，歐陽錫林，等.唯酶紅細(xì)胞抗體的血型血清學(xué)特性的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003，5：527-529.