吳朝偉，向 珊，向 敏，袁德培，袁 林

（1.湖北省恩施市中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

三百棒對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3表達(dá)的影響

吳朝偉1，向 珊1，向 敏1，袁德培2，袁 林2

（1.湖北省恩施市中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

目的：觀察三百棒對(duì)完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）表達(dá)的影響，以探討三百棒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的潛在機(jī)制。方法：用弗氏完全佐劑注射于大鼠右后肢足墊皮內(nèi)致炎，制成AA大鼠模型，致炎后第21天開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)4周。免疫組化法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3表達(dá)的水平。結(jié)果：各治療組VEGF、MMP-3的表達(dá)明顯低于模型組（P＜0．05）。結(jié)論：三百棒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能抑制滑膜中VEGF、MMP-3的表達(dá)水平相關(guān)。

大鼠；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型；三百棒；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-3

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾?。?］。目前對(duì)該病的病因病機(jī)尚無(wú)定論，但研究表明免疫紊亂、細(xì)胞因子分泌失常、血管增生、關(guān)節(jié)滑膜增厚、軟骨及骨的破壞可最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在介導(dǎo)血管增生中起主要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases-3，MMP-3）是破壞軟骨及骨的關(guān)鍵因素。三百棒（Toddalia asiatica）是湖北土家族地區(qū)廣泛用于治療風(fēng)濕病的民族藥。我們觀察了三百棒對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中VEGF、MMP-3的表達(dá)，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模

AD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購(gòu)買于武漢市湖北省疾病防疫控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)42000600001876），許可證號(hào)SCXK（鄂）2008-0005。

除正常組外，其余組每只大鼠于后右足皮內(nèi)注射0.1mL弗氏完全佐劑（FCA）進(jìn)行造模，造模方法參照參考文獻(xiàn)［2］。各大鼠致炎后24h內(nèi)出現(xiàn)原發(fā)性足趾腫脹高峰，1周腫脹減輕，致炎12天后出現(xiàn)繼發(fā)性足趾關(guān)節(jié)腫脹，有些大鼠尾部伴有明顯風(fēng)濕結(jié)節(jié)。

1.2 藥物及試劑

三百棒根皮采挖于恩施山區(qū)，在湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分別提取三百棒乙醇提取液和三百棒水提取液，濃縮成1g/mL的藥液，4℃冰箱保存。雷公藤多苷片購(gòu)買于湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院門診部，批號(hào)120603，將雷公藤多苷片研磨成粉加蒸餾水稀釋成2mg/mL混懸液，放入4℃冰箱保存。弗氏完全佐劑由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)Lot#13909。VEGF免疫組織化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130910。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物分組及給藥：50只AD大鼠隨機(jī)分為：正常組、模型組、雷公藤多苷片治療組（對(duì)照組）、三百棒乙醇提取液治療組（三醇組）、三百棒水提取液治療組（三水組），每組10只。致炎后第21天開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)，三醇組和三水組分別給予相應(yīng)提取液3g/（kg·d）；對(duì)照組給于雷公藤多苷片6.3mg/（kg·d），正常組和模型組給與等體積生理鹽水，給藥體積0.01mL/g，連續(xù)4周。

標(biāo)本采集：各組在末次給藥后（藥物干預(yù)28天），禁水禁食一晚，第2天進(jìn)行標(biāo)本采集。大鼠進(jìn)行頸部脫臼處死，然后將大鼠浸泡在新潔爾滅消毒液中5min。于膝關(guān)節(jié)正中縱向切開(kāi)皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)，在髕骨上緣橫向切斷上面的肌肉和韌帶，在從髕骨兩側(cè)向下分離，然后翻開(kāi)髕骨，打開(kāi)膝關(guān)節(jié)，可以看見(jiàn)髕骨下緣韌帶上附著一層微黃發(fā)亮的組織，即滑膜組織，用手術(shù)刀將其分離出來(lái)。用同樣的方法采集另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織。

免疫組化檢測(cè)：將滑膜組織放入石蠟包埋盒中，浸泡在10%福爾馬林中進(jìn)行固定，脫鈣后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)滑膜中VEGF、MMP-3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每張免疫組化切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野并采集圖片，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus6.0）對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出陽(yáng)性細(xì)胞的平均積分吸光度（OD值），計(jì)算均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

VEGF、MMP-3免疫組化標(biāo)記均定為于細(xì)胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞漿呈棕黃色。由二者免疫組化的圖像可以看見(jiàn)，RA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的胞漿中布滿大量的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞顆粒。正常組滑膜細(xì)胞胞漿中棕黃色陽(yáng)性顆粒分布很少且較均勻。對(duì)照組、三醇組、三水組滑膜細(xì)胞胞漿中棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞顆粒數(shù)量介于正常組和模型組之間，且與模型組相比陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均有不同程度的減少，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF、MMP3表達(dá)比較 （OD值，±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF、MMP3表達(dá)比較 （OD值，±s）

注：與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n 用藥劑量 VEGF MMP-3正常組 10 - 437.56±15.46 201.06土17.63模型組 10 - 1502.49±76.32#544.67±22.85#對(duì)照組 9 6.3mg/（kg·d） 929.89±61.86△423.99土28.19△三醇組 9 3g/（kg·d） 970.94±18.78△432.32±30.08△三水組 9 3g/（kg·d） 1017.34±18.78△436.32±27.08△

3 討 論

目前普遍認(rèn)為RA是一種血管過(guò)度增生性疾病。血管的新生是病理基礎(chǔ)，隨著血管的增生，血管翳的形成，并不斷侵犯軟骨和骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形功能喪失。實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管翳形成及對(duì)軟骨和骨侵蝕破壞的的重要細(xì)胞因子是VEGF、MMP-3［3］。

關(guān)節(jié)滑膜中微血管增生是一個(gè)復(fù)合過(guò)程，是很多因子共同作用的結(jié)果，其中VEGF是最為重要的細(xì)胞因子。VEGF在RA早期就已經(jīng)出現(xiàn)并持續(xù)存在疾病的全過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)滑膜最早出現(xiàn)的病理改變就是血管增生，大量炎癥細(xì)胞和介質(zhì)，如IL-l、TNF-α等可以上調(diào)VEGF的表達(dá)［4］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF水表下降與臨床癥狀改善相關(guān)，并與臨床檢測(cè)指標(biāo)血沉、C-反應(yīng)蛋白含量成正相關(guān)，RA早起表達(dá)水平越高與后期關(guān)節(jié)損傷程度越嚴(yán)重，在臨床上應(yīng)用抗VEGF治療RA能夠延緩疾病的進(jìn)展，改善臨床癥狀［5］。

研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是在RA發(fā)病過(guò)程中起重要作用的酶類，尤其是病變后期介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞［6］。其中MMP-3是檢測(cè)病情活動(dòng)和預(yù)測(cè)治療關(guān)節(jié)軟骨破壞程度的重要指標(biāo)之一［7］。研究報(bào)道MMP3與RA病情活動(dòng)相關(guān)，與RA患者血清中血沉、C-反應(yīng)蛋白成正相關(guān)，在關(guān)節(jié)軟骨破壞中扮演重要角色［8］。目前，RA尚不能根治，后期會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形功能失常，所以防止關(guān)節(jié)破壞、保護(hù)關(guān)節(jié)功能也成為治療RA的目標(biāo)。只有控制滑膜血管新生，減少關(guān)節(jié)軟骨降解，才能達(dá)到防治關(guān)節(jié)破壞，保護(hù)關(guān)節(jié)功能的目的。早發(fā)現(xiàn)早治療及時(shí)控制病情是減少關(guān)節(jié)受損的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3表達(dá)均升高，與正常組相比有顯著差異，表明二者與RA的發(fā)病關(guān)系密切。三百棒治療組和雷公藤多苷片治療組，滑膜中VEGF、MMP3的表達(dá)都有所降低，和模型組比較有顯著差異，說(shuō)明三百棒具有與雷公藤多苷片類似的作用，能抑制AA大鼠模型滑膜中VEGF、MMP3的表達(dá)，抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展，減少血管增生、軟骨降解，從而改善RA病情。

［1］ 葛均波．內(nèi)科學(xué)［M］．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：808．

［2］ 李儀奎．中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006；750-751．

［3］ Konttinen YT，Ainola M，Valleala H，et al．Analysis of 16 different matrix metalloproteinases （MMP-1 to MMP-20） in the synovial membrane：different profiles in trauma and rheumatoid arthritis［J］．Ann．Rheum．Dis，1999，58：691-697．

［4］ 謝建民，余步云，陸才生．VEGF在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑液中的表達(dá)及上調(diào)MMP-2活性的研究［J］．中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10（8）：495-497．

［5］ Cho ML，Jung YO，Min SY，et al．Interleukin-18 induces the Produetion of vaseular endothelal growth factor（VEGF） in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts via AP-l-dependent pathways［J］．Immunology Letters，2006，103（2）：159-166．

［6］ 儲(chǔ)永良，黃清春．血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性［J］．中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005，9（6）：359-361．

［7］ 吳志美，袁建芬，陳均．類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中GPI、MMP-3和抗CCP抗體水平的研究［J］．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，15：1706-1707，1709．

［8］ 吳素玲．痹痛靈顆粒對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜保護(hù)機(jī)理的研究［D］．南京中醫(yī)藥大學(xué)，2010．

Objective：to observe the effects of Ethnic drugs Sanbaibang （Toddaliae Asiaticae） on VEGF、MMP-3 in Synovial of RA Rats，and explore its potential mechanism.Methods：The AA models were built by injected Freund’s complete adjuvant in right and hind foot of rats.After molding 21th，Giving the medication.To detect the content of VEGF andMMP-3 in Synovial of RA Rats by Immunohistochemistry method.Results：VEGF and MMP-3 in each treatment group was significantly lower than the model group（P＜0.05）.Conclusion：It，s mechanism that may inhibit the VEGF and MMP-3 of Synovial of RA Rats.

Toddaliae Asiaticae；VEGF；MMP-3

R285.6

B

1004-2814（2014）12-1079-02

2014-07-18

國(guó)家自科基金（81360672），湖北省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

袁 林