胡志偉，鐘愛華(浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山316022)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)是指一種會(huì)使未受損的有機(jī)體發(fā)生逆向健康影響或者有機(jī)體后代的內(nèi)分泌功能發(fā)生改變的外源性物質(zhì)。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物主要包括天然激素、人工合成的激素化合物和具有內(nèi)分泌活性或抗內(nèi)分泌活性的化合物［1］。炔雌醇(EE2)是一種常見的EDCs，是合成避孕藥的常用成分之一，通過污水處理系統(tǒng)進(jìn)入水環(huán)境。在污水處理系統(tǒng)排出的水中，炔雌醇的濃度可達(dá)7.2～42.0 ng/L。約5.7%的美國河流中炔雌醇含量超過5 ng/L。由于炔雌醇的半衰期長及生物富集作用，魚體內(nèi)炔雌醇的含量可比自然環(huán)境中高332倍，而且炔雌醇的雌激素作用在生物體內(nèi)為雌二醇和雌激素酮的10～50倍。菲(C14H10，PHE)是一種多環(huán)芳烴，由3個(gè)苯環(huán)連接而成，化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，具有“K區(qū)”(即9，10雙鍵)，菲是水環(huán)境中一種重要的有機(jī)污染物，在全國的各個(gè)水域，菲含量均偏高:中國大亞灣海域的次表層海水中菲的含量高達(dá)435 ng/L［2］，珠江的澳門水域的表層水中菲的含量為101.82 ng/L［3］，廈門的馬鑾灣海水養(yǎng)殖區(qū)的表層海水菲的含量為24.4 ng/L［4］。PHE屬于多環(huán)芳烴類物質(zhì)，在水環(huán)境中作為性激素類似物，可對(duì)魚類與繁殖有關(guān)的形態(tài)、行為和生理功能產(chǎn)生重要影響。研究表明，PHE能夠在魚組織中富集，并誘導(dǎo)抗氧化酶的激活［5］。PHE可能通過誘導(dǎo)抗氧化酶，同時(shí)抑制芳香族化合物受體的正?；钚裕蓴_芳香化酶系統(tǒng)從而擾亂性激素的代謝。

斑馬魚具有容易飼育、突變種多、遺傳學(xué)工具成熟等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育與人類遺傳疾病的新興模式生物;此外，斑馬魚的基因組中含有約30 000個(gè)基因，與人類差異不大，并且它的許多基因與人類的基因有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。美國環(huán)境保護(hù)署和經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織將斑馬魚列為研究內(nèi)分泌干擾物對(duì)脊椎動(dòng)物影響的模式生物之一。鑒于炔雌醇和菲在環(huán)境中的廣泛分布，2種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可對(duì)魚類生長發(fā)育產(chǎn)生影響。筆者綜述了炔雌醇和菲2種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)斑馬魚的影響及其機(jī)制的進(jìn)展，為深入研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)魚類以及其他高等脊椎動(dòng)物的生長發(fā)育影響提供一定的參考。

1 炔雌醇對(duì)斑馬魚的影響

1.1 對(duì)斑馬魚生長的影響 將孵化后20 d的斑馬魚暴露在炔雌醇下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明用17-α炔雌醇處理過的斑馬魚生長發(fā)育顯著減慢，體重和體長都明顯低于對(duì)照組，并且斑馬魚的平均體長與EE2暴露濃度呈負(fù)相關(guān)［6］。EE2處理組體重為(0.132 ±0.031)g，空白對(duì)照組為(0.175 ±0.034)g，與空白對(duì)照相比，EE2組體重極顯著下降(P＜0.01)。這表明EE2能顯著影響斑馬魚的體長和體重。

1.2 對(duì)斑馬魚性別比例的影響 EE2能影響斑馬魚生殖功能，主要是由于EE2干擾斑馬魚性腺的發(fā)育分化［7］。與Scholz和Gutzeit發(fā)現(xiàn)在100 ng/LEE2處理組中所有的雄性青魚都發(fā)生了性別逆轉(zhuǎn)［8］這一結(jié)果相似，斑馬魚在0.4 ng/L EE2處理組的性腺與對(duì)照組無明顯差異，然而2 ng/L EE2組大部分魚(16/20)的性腺為幼稚的卵巢樣組織，10 ng/LEE2暴露組雌魚的比率明顯高于對(duì)照組，且差異顯著。研究表明，斑馬魚暴露于含有EE2的水環(huán)境中，可以導(dǎo)致雄性斑馬魚雌性化，性別比例改變以及生殖功能受損［9－10］，主要是干擾了斑馬魚的性腺發(fā)育分化。將EE2處理組及對(duì)照組斑馬魚恢復(fù)至清水中后至180 dPh時(shí)，通過性腺組織切片檢查發(fā)現(xiàn)斑馬魚的性別比例恢復(fù)了正常，但是在處理組中能發(fā)現(xiàn)有明顯的生精小管畸形及精子數(shù)量減少，說明EE2暴露對(duì)斑馬魚性腺發(fā)育分化有一定的可逆性［11］。

1.3 對(duì)斑馬魚VTG蛋白含量的影響 卵黃生成素(Vitellogenin，VTG)在動(dòng)物性成熟過程中起著重要的作用，是由雌激素和類雌激素誘導(dǎo)在肝細(xì)胞表達(dá)的大分子蛋白質(zhì)，為脂蛋白——卵黃蛋白的前體，是發(fā)育早期就存在的一個(gè)敏感的雌激素污染生物標(biāo)志物。VTG是特異地存在于非哺乳類性成熟的卵生雌性動(dòng)物血液中的一種蛋白，內(nèi)源或外源性雌激素能刺激卵生動(dòng)物的肝細(xì)胞產(chǎn)生VTG，通過血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)铰殉?，作為卵黃蛋白的營養(yǎng)支持。幼魚和雄魚在正常情況下不合成VTG，但在受到雌激素和類雌激素刺激時(shí)能合成VTG，導(dǎo)致魚體中VTG濃度升高，雌性化個(gè)體增加，測(cè)定其血清或整體的VTG含量，可反映環(huán)境中某些類雌激素物質(zhì)的存在及其效應(yīng)，VTG已經(jīng)成為水體中EEs污染的重要生物標(biāo)志物［12］。將斑馬魚暴露在EE2，檢測(cè)卵黃蛋白原VTG蛋白含量的變化，標(biāo)記綠色熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)在21 dph時(shí)在10 ng/L處理組中首次發(fā)現(xiàn)VTG的mRNA;28 dph以后，其表達(dá)水平進(jìn)一步升高，在28 dph時(shí)肝臟熒光亮度和熒光區(qū)域均有所增加［11］，熒光增加表示mRNA合成增加，對(duì)照組斑馬魚的肝臟中均未看到明顯熒光，表明EE2能促使VTG合成。

1.4 對(duì)斑馬魚的其他影響 在EE2暴露過程中觀察到隨著的時(shí)間推移死亡率逐漸增加，90 dph時(shí)暴露在濃度為2和10 ng/L EE2中的斑馬魚死亡率均超過了60%，且將斑馬魚暴露于100 ng/L的EE2下至60 dPh可導(dǎo)致死亡率明顯增高［13］。在暴露40 dph后，部分斑馬魚出現(xiàn)了心包水腫，心包水腫發(fā)生率與暴露濃度呈線性相關(guān)［11］。隨著暴露時(shí)間的延長，斑馬魚的死亡率和心包水腫的發(fā)生率都增大了，心包水腫是一種常見的非特異毒性的指標(biāo)，因此2～10 ng/L EE2的暴露已經(jīng)具有一定的非特異毒性作用。由于心包水腫情況嚴(yán)重，同等體長的情況下增加了體重，可通過體重和體長的對(duì)比性作為EE2暴露的指標(biāo)之一。

2 菲對(duì)斑馬魚的影響

2.1 對(duì)斑馬魚鰓和肝組織的影響 經(jīng)菲溶液暴露后，斑馬魚的鰓組織均受到損傷，鰓小片上皮細(xì)胞發(fā)生肥大和水腫，并且濃度越高，發(fā)生鰓絲上皮增厚、鰓小片上皮細(xì)胞水腫程度增加，部分鰓小片上皮表現(xiàn)明顯隆起、少數(shù)鰓小片上皮細(xì)胞發(fā)生壞死與脫落，魚的鰓組織受到的損傷加重。將菲作為水環(huán)境中的主要變化因子，當(dāng)魚被暴露在低濃度的菲溶液中時(shí)，斑馬魚的鰓小片發(fā)生了肥大和水腫，屬于防御反應(yīng);當(dāng)菲溶液濃度較大時(shí)，魚的鰓小片上皮發(fā)生明顯隆起，且少數(shù)鰓上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死和脫落等現(xiàn)象，已經(jīng)對(duì)魚體產(chǎn)生嚴(yán)重的直接損傷。當(dāng)斑馬魚被暴露在菲溶液中時(shí)，部分肝細(xì)胞發(fā)生了腫大，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，少數(shù)細(xì)胞核變形，而當(dāng)菲溶液濃度升高時(shí)，魚的肝細(xì)胞損傷程度增大除了發(fā)生腫大外，還表現(xiàn)為細(xì)胞形狀變得不規(guī)則，細(xì)胞核發(fā)生嚴(yán)重萎縮變形及偏離細(xì)胞中心，胞質(zhì)中空泡化程度加重，部分肝細(xì)胞的核溶解或細(xì)胞溶解造成肝組織發(fā)生局部壞死。在菲溶液中暴露后的斑馬魚，其體質(zhì)量偏低，說明鰓的氣體和物質(zhì)交換受阻，營養(yǎng)不足，再加上肝臟損害，影響了機(jī)體的新陳代謝［14］。

2.2 對(duì)斑馬魚繁殖行為的影響 PHE屬于多環(huán)芳烴類物質(zhì)，在水環(huán)境中作為性激素類似物，可對(duì)魚類與繁殖有關(guān)的形態(tài)、行為和生理功能產(chǎn)生重要影響。魚類繁殖行為的確定方法一般在觀察的30 min內(nèi)，根據(jù)雌、雄魚相互追逐、繞圈游動(dòng)和雄魚用吻部碰觸雌魚腹部3種典型繁殖行為出現(xiàn)的頻率，給斑馬魚繁殖行為的明顯性賦值即繁殖行為指數(shù)［15］。對(duì)性別分化已完成的斑馬魚進(jìn)行短期PHE暴露，記錄在PHE短期暴露下各試驗(yàn)組的斑馬魚繁殖行為指數(shù)，用于反映PHE對(duì)斑馬魚繁殖行為的影響，發(fā)現(xiàn)斑馬魚繁殖行為受到了明顯的抑制，結(jié)果表明在低濃度的試驗(yàn)組和對(duì)照組斑馬魚的繁殖行為無顯著差異，仍有明顯的繁殖行為，如雌雄魚激烈地相互追逐，繞圈游動(dòng)現(xiàn)象較頻繁，多次觀察到雄魚用吻部碰觸雌魚腹部的協(xié)助排卵行為;在PHE質(zhì)量濃度較高的試驗(yàn)組中，繁殖行為顯著減少，斑馬魚興奮性差，大多數(shù)都是平靜地游動(dòng)，很少有相互追逐的現(xiàn)象，幾乎沒有2條魚之間相互接觸的現(xiàn)象。

2.3 對(duì)斑馬魚產(chǎn)卵量、受精率、孵化率和仔魚死亡率的影響 將性成熟的斑馬魚分別暴露在PHE質(zhì)量濃度為0、0.05、0.50、5.00 和50.00 μg/L 的水中7 d 后，將其配對(duì)進(jìn)行繁殖，配對(duì)24 h后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵量、受精率，受精卵3 d內(nèi)的孵化率以及仔魚7 d內(nèi)的死亡率。結(jié)果表明，隨著PHE的逐漸升高，斑馬魚的產(chǎn)卵量逐漸下降，即PHE對(duì)斑馬魚的產(chǎn)卵量有顯著的抑制作用。對(duì)照組與低濃度組在產(chǎn)卵量上沒有較大差異，而高濃度的抑制作用則很明顯，與對(duì)照組差異較大。統(tǒng)計(jì)7 d后各組斑馬魚所產(chǎn)卵的平均受精率，暴露在低質(zhì)量濃度PHE中的斑馬魚的受精率與對(duì)照組無明顯差異，在受精率的數(shù)值上甚至比對(duì)照組略高。PHE質(zhì)量濃度分別為0.50、5.00 和50.00 μg/L 的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著差異，且隨著PHE質(zhì)量濃度的升高，抑制作用呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。當(dāng)PHE小于5 μg/L時(shí)，PHE對(duì)斑馬魚的孵化肯有一定的促進(jìn)作用，且孵化率高于空白對(duì)照組，但是促進(jìn)作用會(huì)隨著質(zhì)量濃度的升高而減弱;當(dāng)PHE的質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/L時(shí)，PHE對(duì)斑馬魚的孵化呈現(xiàn)抑制作用。對(duì)于7 d內(nèi)斑馬魚仔魚的死亡率無顯著的相關(guān)性。在低質(zhì)量濃度0.05 μg/L的PHE中，斑馬魚的產(chǎn)卵行為受到了微弱的抑制作用，卻對(duì)卵受精具有微弱的促進(jìn)作用，但是二者的作用都不顯著，并且在暴露在PHE的這段時(shí)間中斑馬魚的繁殖行為還沒有受到影響。較低濃度PHE(≤5 μg/L)處理下，卵的孵化受到了促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用會(huì)隨著PHE濃度的升高而下降。綜上所述，高PHE(≥0.5 μg/L)對(duì)斑馬魚的繁殖行為、產(chǎn)卵量和受精率，都產(chǎn)生較為顯著的抑制作用。而低濃度PHE(≤0.05 μg/L)對(duì)斑馬魚的繁殖行為、產(chǎn)卵量和受精率的影響較為微弱。暴露在低質(zhì)量濃度的PHE可促進(jìn)斑馬魚卵的孵化，但這種作用會(huì)隨著濃度的升高而逐漸減弱，高濃度則反而會(huì)抑制斑馬魚卵的孵化［16］。

3 展望

在我國，EDCs污染研究控制中還有許多問題，如研究不足，情況不明;來源不明，總量增加;政策缺乏，難于控制。許多城市飲用水中均含有HCHs和DDTs，即使空氣中EDCs的濃度水平較低但仍不能忽視。有關(guān)雌二醇、壬基酚、雙酚A等內(nèi)分泌干擾物質(zhì)對(duì)斑馬魚繁殖行為的影響，Brion［17］研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚暴露于雌二醇中，其繁殖行為包括產(chǎn)卵量、孵化率等將受到一定影響。沈萬赟等研究發(fā)現(xiàn)壬基酚和雙酚A分別作用下對(duì)斑馬魚的繁殖行為產(chǎn)生抑制作用，二者協(xié)同使用甚至可能終止斑馬魚的繁殖行為［18－19］。內(nèi)分泌干擾物可通過作用于下丘腦－腦垂體－性腺軸的內(nèi)分泌系統(tǒng)途徑，影響重要激素或者受體，并最終影響動(dòng)物的繁殖;也可作用于下丘腦－腦垂體－甲狀腺軸途徑，影響甲狀腺激素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合等過程，破壞甲狀腺激素內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而對(duì)生長發(fā)育造成危害［20］。美國環(huán)保署己經(jīng)將內(nèi)分泌干擾物列為高度優(yōu)先研究和控制的污染物，并于1999年開始實(shí)施內(nèi)分泌干擾物篩選行動(dòng)計(jì)劃，組織篩選環(huán)境中具有雌激素活性或能阻斷雌激素活性的化學(xué)物質(zhì)［21－22］，英國環(huán)保部將內(nèi)分泌干擾類物質(zhì)的生產(chǎn)和排放加以控制，如禁止壬基酚、聚氧乙烯醚類表面活性劑的使用等，于2000年實(shí)施內(nèi)分泌干擾物的研究行動(dòng)計(jì)劃。我國對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究正處于起步階段。面對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒理學(xué)和污染，我國現(xiàn)在還缺乏系統(tǒng)的環(huán)境內(nèi)分干擾物的研究。筆者綜述了決雌醇和菲對(duì)斑馬魚的影響，可為我國的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究提供－些資料。

［1］鄧茂先，陳祥貴.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2000，27(2):65 －68.

［2］丘耀文，周俊良，MASKAOUI K，等.大亞灣海域水體和沉積物中多環(huán)芳烴分布及其生態(tài)危害評(píng)價(jià)［J］.熱帶海洋學(xué)報(bào)，2004，23(4):72 －80.

［3］楊清書，麥碧嫻，羅孝俊，等.珠江澳門水域水柱多環(huán)芳烴初步研究［J］.環(huán)境科學(xué)研究，2004，17(3):28 －33.

［4］田蘊(yùn)，鄭天凌，王新紅，等.廈門馬鑾灣養(yǎng)殖海區(qū)多環(huán)芳烴的污染特征［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2003，22(1):29 －33.

［5］SUN Y Y，YU H X，ZHANG J F，et al.Bioaccumulation，depuration and oxidative stress in fish Carassius auratus under phenanthrene exposure［J］.Chemosphere，2006，63(8):1319 －1328.

［6］李潔斐，李衛(wèi)華，楊健，等.17-α炔雌醇對(duì)斑馬魚的卵黃蛋白原及性腺發(fā)育的影響［J］.毒理學(xué)雜志，2006，20(1):9 －13.

［7］HILL R L JR，JANZ D M.Developmental estrogenic exposure in zebrafish(Danio rerio):I.Effects on sex ratio and breeding success［J］.Aquat Toxico，2003，163(4):417 －429.

［8］SCHOLTZ S，GUTZEIT H O.17 b-ethynylestradiol affects reproduction，sexual differentiation and aromatase gene expression of the medaka(Oryzias latipes)［J］.Aquat Toxicol，2000，150(6):363 －373.

［9］LARSSON D G J，ADOLFSSON M，PARKKONEN J，et al.Ethinyloestradiol-an undesired fish contraceptive［J］.Aquat Toxieo，1999，145(2):91 －97.

［10］IsLINGER M，WILLIMSKI D，VOLK1 A，et al.Effects of 17a-ethinylestradiol on the expression of three estrogen-responsive genes and cellular ultrastructure of liver and testes in male zebraflsh［J］.Aquat Toxieo，2003，162(2):85－103.

［11］徐繪.17α-炔雌醇對(duì)斑馬魚生殖系統(tǒng)的影響及其機(jī)理的研究［D］.上海:復(fù)旦大學(xué)，2009.

［12］CHEN H，YANG J，WANG Y X，et al.Development of a Transgenic Zebrafish in Which The Expression of EGFP Is Driven by vtg1 Promoter［J］.Progress in Biochemistry and Biophysics(China).2006，33(10):965 －970.

［13］HILL R L JR，JANZ D M.Developmental estrogenic exposure in zebrafish(Danio rerio):Ⅰ.Effects on sex ratio and breeding success［J］.Aquat Toxicol，2003，163(4):417 －429.

［14］吳玲玲，陳玲，張亞雷，等.菲對(duì)斑馬魚鰓和肝組織結(jié)構(gòu)的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2007，26(5):688 －692.

［15］KEI NAKAYAMA，YUJI OSHIMA，TOMOMI YAMAGUCHI，et al.Fertilization success and sexual behavior in male medaka，Oryzias latipes，，exposed to tributyltin［J］.Chemosphere，2004，55:13 －31.

［16］譚燕，李遠(yuǎn)友.魚類在內(nèi)分泌干擾研究中的應(yīng)用［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2006，25(11):583－588.

［17］BRION F，TYLER C R，PALAZZI X，et al.Impacts of 17beta-estradiol，including environmentally relevant concentrations，on reproduction after exposure during embryo-，larval-，juvenile-and adult-life stages in zebra fish(Danio rerio)［J］.Aquatic Toxicol，2004，168(2):193 －202.

［18］沈萬赟，周忠良，李祥軍.雙酚A和壬基酚長期暴露對(duì)斑馬魚繁殖的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007，31(9):59 －64

［19］吳玲玲，明璽，陳玲，等.長江口水域菲含量及對(duì)斑馬魚組織結(jié)構(gòu)的影響［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30(7):13 －22

［21］ROBERT J，KAVLOCK T，GEOORGE P，et al.Research needs for the risk assessment of health and environmental effects of endocrine disruptors:a report of the U.S.EPA-sponsored workshop［J］.Environ Health Persp，1996，104(S4):715 －740.

［22］LAW RENCE W，REITER T.The U.S.Federal framework for research on endocrine disruptors and an analysis of research programs supported during Fiscal Year［J］.Environ Health Persp，1998，106(3):105 －113.