周恒偉，鄒丹，白大峰，金戈，唐迪瑩，張祖源，王蒙，李欣欣，張怡光

（1.沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院門(mén)診藥房，沈陽(yáng)110101；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034）

水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

周恒偉1，鄒丹2，白大峰1，金戈2，唐迪瑩2，張祖源2，王蒙2，李欣欣2，張怡光2

（1.沈陽(yáng)市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院門(mén)診藥房，沈陽(yáng)110101；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034）

目的探討水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用。方法健康費(fèi)城癌癥研究所（ICR）小鼠（60只）隨機(jī)均分為4組：假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量（100 mg·kg-1·d-1）組和水飛薊賓高劑量（200 mg·kg-1·d-1）組。連續(xù)給藥8 d，行為學(xué)評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶的改善作用。結(jié)果與模型組比較，水飛薊賓高劑量組自發(fā)反應(yīng)交替率，1 h、24 h優(yōu)先指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：與模型組比較，水飛薊賓高劑量組IL-6表達(dá)顯著降低，水飛薊賓高劑量組IL-4表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。結(jié)論水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。其機(jī)制可能通過(guò)降低腦組織中的炎癥相關(guān)因子水平有關(guān)。

水飛薊賓；學(xué)習(xí)記憶障礙；炎性因子

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退、嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙和人格異常［1］。此病起病隱匿，病程進(jìn)行緩慢，是老年癡呆中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型。AD患者腦內(nèi)的主要病理改變包括細(xì)胞外以β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積為中心形成的老年斑（senile plaques，SP）、過(guò)度磷酸化tau蛋白造成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）、選擇性神經(jīng)元丟失及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良、突觸丟失等。此外，AD的產(chǎn)生和發(fā)展還與炎性反應(yīng)、線粒體結(jié)構(gòu)功能異常等密切相關(guān)［2］。研究報(bào)道，水飛薊賓能夠?qū)笰β引起的短期空間記憶、長(zhǎng)期識(shí)別記憶以及關(guān)聯(lián)記憶的損傷，但是并不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、探索行為和痛閾。此外，水飛薊賓顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的海馬區(qū)丙二醛（malondialdehyde，MDA）的產(chǎn)生，同時(shí)升高谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平［3］。為了進(jìn)一步探索水飛薊賓在AD治療中的作用，本研究探討水飛薊賓對(duì)Aβ1-42致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠側(cè)腦室注射凝聚態(tài)Aβ1-42致癡呆模型的制作：清潔級(jí)健康費(fèi)城癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠60只，雄性，體質(zhì)量24～30 g，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠水合氯醛麻醉后，微量進(jìn)樣器側(cè)腦室一次性注入4 μL凝聚態(tài)Aβ1-42（含Aβ1-42 410 pmol）。留針2 min，假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室給予等體積生理鹽水。Aβ1-42預(yù)處理：無(wú)菌生理鹽水溶解后，37℃120 h使其成凝聚態(tài)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：造模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量組和水飛薊賓高劑量組。實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后給藥。假手術(shù)組及模型組按體質(zhì)量給予生理鹽水，多奈哌齊組給予多奈哌齊（1.3 mg·kg-1·d-1），水飛薊賓組給予不同劑量水飛薊賓（低劑量為100 mg·kg-1·d-1；高劑量為200 mg·kg-1·d-1）；恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng)［（24±1）℃，（40±4）%］，12 h循環(huán)燈光（08：00-20：00），自由攝食及飲水。給藥期間每天稱重，觀察動(dòng)物狀態(tài)并記錄。連續(xù)給藥8 d后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 藥品、試劑及儀器

水飛薊賓（河南協(xié)力藥業(yè)公司，批號(hào)：20130804）、A β 1-42（Sigama公司，批號(hào)：1001602474）、小鼠白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）ELISA試劑盒（貨號(hào)：MU30384，上海邦亦生物公司）、小鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號(hào)：MU30044，上海邦亦生物公司）。酶標(biāo)定量測(cè)試儀（奧地利特TECAN公司）、-80℃低溫冰箱（中科美菱）；J2-SH低溫超速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；機(jī)械勻漿機(jī)（上海凈信科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Y迷宮：實(shí)驗(yàn)裝置由3個(gè)成120°夾角的等長(zhǎng)木制支臂組成，即迷宮的A、B、C 3臂。每臂長(zhǎng)40 cm，高12 cm，上寬10 cm，下寬4 cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入3個(gè)臂交接處，讓其自由出入3個(gè)臂，記錄4 min內(nèi)每只小鼠進(jìn)入3個(gè)臂的順序及總次數(shù)，以連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同的臂為1次正確交替反應(yīng)，記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)。用自發(fā)交替反應(yīng)率反映空間工作記憶能力。自發(fā)反應(yīng)交替率（%）=正確進(jìn)臂次數(shù)/（進(jìn)臂總次數(shù)-2）×100［4］。

1.2.2 小鼠新物體辨別：本實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)環(huán)境階段和測(cè)試階段。適應(yīng)環(huán)境階段：每只小鼠放入測(cè)試箱自由探索10 min，連續(xù)2 d。測(cè)試階段，同樣小鼠適應(yīng)環(huán)境3 min，然后將小鼠取出。將2個(gè)完全相同的測(cè)試物體（A1、A2）置于測(cè)試箱距箱壁8 cm處呈直線排開(kāi)。每組小鼠面向盒壁放入盒中，記錄4 min內(nèi)探索兩物體的時(shí)間（tA1、tA2）。1 h后，將其中原來(lái)測(cè)試物體物體中1個(gè)換成1個(gè)新物體（B），將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時(shí)間（tA1、tB）。24 h后，將物體B換成1個(gè)新物體（C），將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時(shí)間（tA1、tC）。優(yōu)先指數(shù)計(jì)算公式：Preferential inde（x1 h/24 h）=tB（/tA1+tB）［4］。

1.2.3 酶聯(lián)免疫法測(cè)定海馬組織IL-6、IL-4含量：各組小鼠于給藥后第8天處死，皮層海馬組織樣本放于-80°C冰箱備用。每只鼠取10 mg海馬組織加入140 μL PBS溶液中，超聲勻漿后3 000g離心14 min后，取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每孔加樣品40 μL，經(jīng)37℃溫育30 min，洗滌4次，37℃避光顯色14 min，終止反應(yīng)后440 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（optical density，OD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 自發(fā)交替反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量組和水飛薊賓高劑量組小鼠進(jìn)入Y迷宮3個(gè)臂的總次數(shù)分別為23.818±3.646、26.012±6.884、24.364±7.684、22.182±4.240、24.444± 7.034，組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.04）。提示水飛薊賓未對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)產(chǎn)生明顯影響。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠Y迷宮自發(fā)交替反應(yīng)率顯著下降（P＜0.001）；與模型組比較，水飛薊賓劑量依賴性增加小鼠Y迷宮自發(fā)交替反應(yīng)率（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 新物體辨別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠1 h及24 h測(cè)試階段的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，水飛薊賓劑量依賴性升高模型鼠1 h及24 h測(cè)試階段的優(yōu)先指數(shù)（P＜0.01），見(jiàn)表2、3。

2.3 各組小鼠海馬組織IL-4、IL-6含量結(jié)果

表1 水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42各組小鼠自發(fā)交替反應(yīng)率及進(jìn)臂總次數(shù)影響（%）Tab.1 Effects of silibinin on the impairment of spontaneous alteration behavior induced by ICV Aβ1-42 in the Y-maze test（%）

表2 水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠新物體辨別1 h及24 h優(yōu)先指數(shù)的影響（%）Tab.2 Effects of silibinin on preferential index for new object of 1 h and 24 h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

表3 水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠新物體辨別1h及24 h辨別系數(shù)的影響（%）Tab.3 Effects of silibinin on discrimination index for new object of 1h and 24h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠抗炎因子IL-4顯著降低而促炎性因子IL-6升高（P＜0.01），與模型相比較，水飛薊賓顯著增加抗炎因子IL-4表達(dá)（P＜0.04），降低IL-6表達(dá)（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

3 討論

神經(jīng)病理學(xué)研究揭示了炎癥與AD密切相關(guān)。AD患者尸檢顯示，腦組織內(nèi)促炎性因子增加，尤其是在斑塊附近增加的更加明顯［6］。IL-6是一種多向性的細(xì)胞因子，與其水溶性受體或膜受體結(jié)合后形成有活性的IL-6受體復(fù)合物，介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。自1991年Bauer等［7］在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)IL-6以來(lái)，已經(jīng)有大量的研究結(jié)果表明，IL-6在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-4是抗炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)成熟T2型輔助細(xì)胞（Th2細(xì)胞）、肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞，能夠趨化Th2應(yīng)答之一；介導(dǎo)肥大細(xì)胞的募集和活化，刺激IgE抗體產(chǎn)生［8］。研究表明IL-4參與AD的發(fā)病機(jī)制［9］。AD患者基底核及外周單核細(xì)胞的IL-4較正常對(duì)照組均減少［10］。流行病學(xué)及臨床觀察發(fā)現(xiàn)抗炎藥物可延遲AD發(fā)病，減緩AD進(jìn)程并改善AD的認(rèn)知障礙。因此抗炎機(jī)制成為防治AD的一個(gè)新的研究方向。

表4 水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠海馬IL-4，IL-6影響Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

表4 水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠海馬IL-4，IL-6影響Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

1）P＜0.01 compared with sham group；2）P＜0.04；3）P＜0.01 compared with model group.

水飛薊賓為黃酮類(lèi)化合物，文獻(xiàn)報(bào)道具有抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用［11］。本次實(shí)驗(yàn)我們考察水飛薊賓是否可以通過(guò)減少炎性因子表達(dá)而產(chǎn)生改善學(xué)習(xí)障礙的作用，行為學(xué)Y迷宮檢測(cè)得出水飛薊賓對(duì)側(cè)腦室注射Aβ1-42模型鼠空間記憶的改善作用；新物體辨別實(shí)驗(yàn)主要考察藥物對(duì)側(cè)腦室注射Aβ 1-42模型鼠視覺(jué)辨別能力的改善作用，結(jié)果顯示水飛薊賓高劑量組對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙改善作用顯著。與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致［3］。實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)小鼠側(cè)腦室注射Aβ后8 d海馬內(nèi)促炎性因子IL-6含量及抗炎性因子IL-4含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明水飛薊賓在改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的同時(shí)，可劑量依賴性地抑制癡呆小鼠海馬IL-6表達(dá)的增加及IL-4表達(dá)的減少。提示水飛薊賓改善認(rèn)知及記憶障礙作用與中樞抗炎作用相關(guān)。前期的研究結(jié)果顯示水飛薊的抗氧化作用明顯，能夠改善藥源性腎損傷［12］，是否可以通過(guò)抗氧化作用和神經(jīng)保護(hù)作用改善學(xué)習(xí)記憶障礙還有待進(jìn)一步探討。

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（編輯 武玉欣）

Silibinin ImprovementofLearning and Memory Disordersin a Dementia Mouse ModelInduced by Intracerebroventricular Injection ofAβ1-42

ZHOU Heng-wei1，ZOU Dan2，BAI Da-feng1，JIN Ge2，TANG Di-ying2，ZHANG Zhu-yuan2，WANG Meng2，LI Xin-xin2，ZHANGYi-guang2
（1.Bureau of Outpatient Medicine，Sujiatun District Central Hospital，Shenyang 110101，China；2.Deparment of Pharmacology，School of Basic Medicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo observe the effectsofsilibinin on the improvementoflearning and memory impairmentin a mouse modelinjected with Aβ 1-42.MethodsA total of 60 healthy ICR mice were randomly divided into sham group，model group，the donepezil group，silibinin low-dose group，silibinin high-dose group.After8 days administration，behavioraltests were performed to evaluate the learning and memory improvement.Re?sultsCompared with the modelgroup，spontaneous alternation behavior，1 hourand 24 hourpreferentialindex silibinin high dose group were significantly improved in silibinin high-dose group.ELISA testshowed that：compared with the modelgroup，silibinin treatmentsignificantly reduced IL-6 and IL-4 expression（P＜0.01）.ConclusionSilibinin significantly improved learning and memory disorders in the mouse dementia model induced by intracerebroventricularinjection ofAβ1-42.The reduction ofinflammation factorlevels in the brain tissue could be one ofthe mechanisms.

silibinin；learning and memory impairment；inflammatory cytokines

R964

A

0248-4646（2014）04-0341-03

沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F13-220-9-27）；遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（L2010447）

周恒偉（1976-），男，主管藥師，本科.

金戈，E-mail：jinge1026@163.com

2014-02-19

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