高秀芝， 蔣霞敏， 張澤凌， 葉 麗， 孫志鵬

(寧波大學海洋學院 寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

微藻作為水域生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)力，具有合成脂肪和多不飽和脂肪酸(PUFA)的能力，且其脂肪不具有魚腥味，脂肪酸組成較簡單，是海洋軟體動物、甲殼動物幼體及魚類仔幼魚的優(yōu)良餌料。海洋微藻作為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等高度不飽和脂肪酸的新來源越來越受到國內(nèi)外科研工作者的重視。大量研究表明：EPA和DHA在營養(yǎng)強化、預防和治療多種疾病方面發(fā)揮著重要作用，如預防心臟病、動脈粥樣硬化，治療癌癥、炎癥、哮喘、糖尿病等取得了良好效果[1]。目前日本和美國已利用微藻規(guī)?；a(chǎn)PUFAs，中國利用微藻技術開發(fā)PUFAs還處于研究階段[2]。到目前為止，已測定了上百個品種微藻的脂肪酸。其中研究最多的是三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、小球藻(Chlorellaspp.)等[3]。本實驗室從浙江海域采集浮游植物，從中分離微藻，最終篩選出5株硅藻，進行了脂肪含量及脂肪酸組成的比較分析，以期為海洋微藻EPA或DHA的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

從浙江漁山列島、朱家尖海域，采用25號浮游生物網(wǎng)拖采，采集的樣品用裝有培養(yǎng)基的透明塑料瓶保存，然后帶入實驗室進行分離。

1.2 微藻的分離

采用平板分離法和水滴分離法對樣品中的微藻進行分離。挑選單細胞進行單種培養(yǎng)，藻株大量繁殖后，進一步鏡檢，反復分離純化，直至分離出純藻株，純種轉入100 mL三角瓶中保存培養(yǎng)。

1.3 微藻的培養(yǎng)

用于培養(yǎng)微藻的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，所用容器均120℃高溫消毒，采用MAV培養(yǎng)基[4]，培養(yǎng)體積5 L，各3平行。培養(yǎng)條件：水溫17～25℃，鹽度25，自然光照，不充氣培養(yǎng)。每天取適量藻液進行計數(shù)以確定指數(shù)生長期。

1.4 總脂的測定

在藻細胞達到指數(shù)生長末期后將藻液離心收集(4000 r/min, 4℃)，冷凍干燥，藻粉于-20℃冷凍保存。稱取100 mg左右的藻粉，參照改進后的Bligh-Dyer法[5]進行總脂含量的測定。

1.5 脂肪酸的測定

采用Bligh-Dyer法抽提總脂，分層后下層氯仿層旋轉蒸發(fā)至恒重，充N2冷凍保存。總脂移入4 mL樣品瓶，加入5%～6%KOH甲醇溶液(V/V 4∶1), 充N21 min。皂化甲酯化過程參照文獻[6]，然后用日本SHIMADZU公司QP2010氣象色譜-質譜分析儀進行分析, 參考脂肪酸標準和參考文獻[7-10]，用面積歸一法計算出各脂肪酸的百分含量(以占脂肪酸含量的百分比表示)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差來表示，利用Excel 2003和SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 實驗結果

2.1 分離藻株的形態(tài)特征

對浙江漁山列島和朱家尖水樣中微藻進行分離、純化，根據(jù)分離純化過程中培養(yǎng)物的顏色變化和細胞特性的觀察，最終篩選出5株易培養(yǎng)、生長穩(wěn)定的藻株，經(jīng)鑒定均為硅藻。表1是5株硅藻的形態(tài)特征，從表1可以看出這5株硅藻的細胞大小為3.0～23.7 μm。其中大龍骨藻(Tropidoneismaxima)和咖啡雙眉藻(Amphoracoffeaeformis)為底棲硅藻，其它3株藻均為浮游硅藻。

表15株海洋微藻的形態(tài)特征

2.2 試驗條件下5株微藻的生長特性

圖1為試驗條件下篩選出的5株微藻一次性培養(yǎng)的生長曲線。根據(jù)藻類細胞增長的情況，確定曼氏骨條藻SM-2012-1(Skeletonemamunzelii)、曼氏骨條藻SM-2012-2、成對海鏈藻(Thalassiosirabinata)的指數(shù)生長期、相對生長下降期和靜止期分別為第3 d、第4 d和第5 d；咖啡雙眉藻和大龍骨藻的指數(shù)生長期、相對生長下降期和靜止期分別為第4 d、第6 d和第8 d。

圖1 試驗條件下5株微藻生長曲線

2.3 試驗條件下5株微藻的生物量

由表2可知，5株微藻中大龍骨藻在培養(yǎng)8 d后生物量最高，為0.204 g/L，其次為咖啡雙眉藻(0.179 g/L)>曼氏骨條藻SM-2012-2(0.053 g/L)>曼氏骨條藻SM-2012-1(0.047 g/L)>成對海鏈藻(0.046 g/L)。

表2 試驗條件下5株微藻的藻株干重

2.4 微藻的脂肪含量

表3是5株海洋微藻的總脂含量。結果顯示，這5株微藻的收獲密度為58×104～197×104cells/mL，曼氏骨條藻SM-2012-2的收獲密度最高，咖啡雙眉藻最低。5株硅藻的總脂含量為15.14%～28.07%，除成對海鏈藻外，其它4株硅藻脂肪含量均高于其干重的20%；大龍骨藻總脂含量最高，咖啡雙眉藻次之，成對海鏈藻最低。

表35株海洋微藻的總脂含量

2.5 5株硅藻的脂肪酸組成

5株硅藻的主要脂肪酸為14:0、16:0、16:1 n-7、16:3 n-4、20:5 n-3，占總脂肪酸的67.65%～77.59%。飽和脂肪酸(SFA)含量為24.94%～30.92%，其中成對海鏈藻的SFA含量最高(30.92%)，其次為曼氏骨條藻SM-2012-1(30.66%)>曼氏骨條藻SM-2012-2(30.18%)>大龍骨藻(27%)>咖啡雙眉藻(24.94%)，對于飽和脂肪酸12:0，只有成對海鏈藻中含有少量，其它4株硅藻未檢測到。5株微藻的單不飽和脂肪酸(MUFA)含量為22.74%～30.26%，其中成對海鏈藻的MUFA含量最高(30.26%)，其次為大龍骨藻(27.21%)>咖啡雙眉藻(25.14%)>曼氏骨條藻SM-2012-1(23.90%)>曼氏骨條藻SM-2012-2(22.74%)。5株微藻的n-3 多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)含量為13.27～30.53%，其中曼氏骨條藻SM-2012-2的n-3 PUFA含量最高，咖啡雙眉藻最低。5株微藻的n-6 PUFA含量為2.67%～22.63%，其中咖啡雙眉藻的n-6 PUFA含量最高，成對海鏈藻最低。PUFA中 20:5 n-3的含量最高，EPA含量從高到低依次為曼氏骨條藻SM-2012-2(27.74%)>曼氏骨條藻SM-2012-1(24.83%)>大龍骨藻(23.08%)>成對海鏈藻(22.04%)>咖啡雙眉藻(12.72%)。5株微藻富含C16PUFAs，其中16:2 n-4，16:3 n-4是主要的組分，并且16:3 n-4的含量均高于16:2 n-4。5株微藻的C18系列脂肪酸組成各有不同，大龍骨藻的C18系列脂肪酸中18:3 n-6 含量最高(2.74%)，18:1 n-9最低(0.69%)；咖啡雙眉藻的C18系列中18:2 n-6最高(1.79%)，而18:1 n-9最低；成對海鏈藻C18系列脂肪酸中18:1 n-7最高(6.58%)，18:3 n-6最低；曼氏骨條藻SM-2012-1和曼氏骨條藻SM-2012-2的C18系列脂肪酸組成相同，變化趨勢相近， C18系列脂肪酸中18:1 n-7含量最高，分別為7.6%、6.28%，18:3 n-3最低，分別為0.32%、0.43%。 5株微藻的20:4 n-6含量為0.12%～17.72%，咖啡雙眉藻最高(17.72%)，大龍骨藻其次(5.66%)，曼氏骨條藻SM-2012-1、曼氏骨條藻SM-2012-2、成對海鏈藻中20:4 n-6的含量極少。 除咖啡雙眉藻外，其它4株微藻都含有一定量的DHA。

表4 5株海洋微藻的脂肪酸組成(%占總脂肪酸含量的百分比)

3 討論

本研究中5株微藻總脂含量為15.14%～28.07%，咖啡雙眉藻總脂含量與Chen[7]報道的雙凸雙眉藻(Amphorabigibba)總脂含量(37.16%)和簡單雙眉藻(Amphoraexigua)總脂含量(33.21%)有所差異，后者是在水溫14～22.5℃，PES培養(yǎng)液中培養(yǎng)49 d后測得，出現(xiàn)此種差異的原因可能是藻株、營養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間等不同所致，但可以看出這3株藻的總脂含量都不低，說明咖啡雙眉藻相對于其他微藻很可能是含油量偏高的一株藻。曼氏骨條藻SM-2012-1、曼氏骨條藻SM-2012-2的總脂含量與 Rodolfi等[11]的報道中肋骨條藻的總脂含量相近。

5株海洋微藻的主要脂肪酸為14:0、16:0、16:1 n-7、16:3 n-4、20:5 n-3，且16:1 n-7的含量均高于16:0，這與Zhukova等[12]報道的硅藻綱的主要脂肪酸組成相一致。5株微藻的飽和脂肪酸(SFA)含量為24.94%～30.92%，其中曼氏骨條藻SM-2012-1的SFA量(30.66%)與Pistocchi等[13]報道的中肋骨條藻在磷限制的f/2 培養(yǎng)條件下測得的SFA含量(33.8%)接近，而Chen[7]報道的中肋骨條藻的SFA為69.46%，后者的培養(yǎng)時間為49 d，培養(yǎng)液為PES，而有研究表明中肋骨條藻隨著培養(yǎng)時間的延長，SFA中的C14:0量增加，EPA降低，因此導致總的SFA增加[12]。Chen[7]報道的簡單雙眉藻的n-3 PUFA含量(13.45%)與本試驗中咖啡雙眉藻n-3 PUFA含量(13.27%)的結果相近。5株微藻的n-6 PUFA含量為2.67%～22.63%，而Chen[7]報道的中肋骨條藻的n-6 PUFA為5.92%，后者培養(yǎng)時間為49 d，遠長于本試驗培養(yǎng)時間，正如前面所述，可能是隨著培養(yǎng)時間的延長，多不飽和脂肪酸含量減少所致。本研究中16:1 n-7/16:0為1.2～1.8，Zhukova等[12]研究的三角褐指藻、中肋骨條藻、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、溢縮角毛藻(Chaetocerosconstrictus)4株硅藻的16:1 n-7/16:0為1.3～2.0，兩者結果較為接近，且有研究表明16:1 n-7含量高于16:0時具有一定的優(yōu)勢。5株微藻均富含EPA，但不同藻株EPA含量相差很大，一些因素可導致這種差距，例如改變微藻的營養(yǎng)和物理條件，其EPA含量也會從1%～3%增至30%～40%，曼氏骨條藻SM-2012-2的EPA含量(27.74%)與 Pistocchi 等[13]報道的中肋骨條藻EPA含量(26.7%)較為接近，然而脂肪酸組成上的變化，特別是EPA的含量極易受溫度、光照及硅酸鹽含量的影響，且有研究表明隨EPA含量的減少，中肋骨條藻的14:0增加。成對海鏈藻的EPA含量(22.04%)與Zhukova等[12]報道的海鏈藻(Thalassiosirasp.)EPA含量(1.75%)和威氏海鏈藻(Thalassiosiraweissflogii)EPA含量(3.8%)差異顯著，導致此差異的原因可能與環(huán)境因子及藻株有關。5株微藻的C18系列脂肪酸的含量較低，這與Chuecas等[14]、Volman等[15]、Nichols等[16]對硅藻的研究結果相符合； 5種微藻中咖啡雙眉藻的20:4 n-6含量高達17.72%，明顯高于Chen[7]報道的簡單雙眉藻(1.44%)和雙凸雙眉藻(1.73%)。24:0在文獻中未被經(jīng)常報道[17]，成對海鏈藻24:0含量(0.11%)與Viso等[17]報道的成對海鏈藻24:0含量(0.1%)基本一致。

本研究中大龍骨藻和咖啡雙眉藻均為底棲硅藻，在本試驗條件下培養(yǎng)6 d后達到相對生長下降期，生長周期較其它3株浮游硅藻(4 d)長些；從生物量方面考慮，大龍骨藻培養(yǎng)至相對生長下降期后生物量(0.204 g/L)遠高于其它3株浮游硅藻；從總脂方面考慮，也是大龍骨藻最高(28.07%)，其次為咖啡雙眉藻(23.58%)、曼氏骨條藻SM-2012-2(22.09%)、曼氏骨條藻SM-2012-1(21.05%)、成對海鏈藻(15.14%)。從EPA含量來看，曼氏骨條藻SM-2012-2的EPA含量最高，為27.74%，其次為曼氏骨條藻SM-2012-1(24.83%)、大龍骨藻(23.08%)、成對海鏈藻(22.04%)、咖啡雙眉藻(12.72%)。從DHA含量來看，成對海鏈藻最高(3.45%)，而大龍骨藻、曼氏骨條藻SM-2012-1、曼氏骨條藻SM-2012-2的DHA含量接近，咖啡雙眉藻則未檢測到DHA。結合咖啡雙眉藻的EPA及DHA含量，可先將咖啡雙眉藻排除暫不開發(fā)的可能性。本研究中收集藻泥時因3株浮游硅藻均易沉降，因此在離心前可先通過虹吸法將藻液濃縮至較少的體積，再離心，方便收集，若在生產(chǎn)上應用，可以大大節(jié)約生產(chǎn)成本。

就目前的研究結果而言，篩選出3株具有開發(fā)潛能的藻株分別是大龍骨藻、曼氏骨條藻SM-2012-1、曼氏骨條藻SM-2012-2，以期更好的開發(fā)利用。需要說明的是，由于5株藻均采用同一營養(yǎng)鹽配方和相同理化條件培養(yǎng)，并不一定代表每種藻的最佳優(yōu)化條件，因此其比較結果存在一定的局限性，這有待于進一步的研究。

參考文獻:

[1]林學政, 李光友. 11種微藻脂類和EPA/DHA組成的研究[J]. 黃渤海海洋, 2000, 18(2): 36-40.

[2]王 銘, 劉 然, 徐 寧, 等. 13種微藻的脂肪酸組成分析[J]. 生態(tài)科學, 2006, 25(6): 542-544.

[3]梁 英, 麥康森. 微藻EPA和DHA 的研究現(xiàn)狀及前景[J]. 水產(chǎn)學報, 2000, 24(3):289-296.

[4]蔣霞敏. 營養(yǎng)與餌料生物實驗教程[M]. 北京:高等教育出版社, 2010, 80-81.

[5]Bligh E G, Dyer W J. A rapid method lipid extraction and purification[J]. Can J Biochem Physiol, 1959, 37: 911-923.

[6]蔣霞敏, 柳敏海, 邢晨光. 不同生態(tài)條件對綠色巴夫藻生長及脂肪酸組成的影響[J]. 水生生物學報, 2007, 31(1):88-93.

[7]Chen Y C. The biomass and total lipid content and composition of twelve species of marine diatoms cultured under various environments[J]. Food Chem, 2012, 131: 211-219.

[8]徐繼林, 嚴小軍, 周成旭, 等. 19種(株)海洋微藻脂肪酸組成及充氣產(chǎn)生的影響[J]. 寧波大學學報, 2006, 29(2): 180-185.

[9]劉夢壇, 李超倫, 孫 松. 兩種甲藻和兩種硅藻脂肪酸組成的比較研究[J]. 海洋科學, 2010, 34(10): 77-82.

[10]曹春暉, 孫世春, 麥康森, 等. 30株海洋綠藻的總脂含量和脂肪酸組成[J]. 青島海洋大學學報, 2000, 30(3): 428-434.

[11]Rodolfi L, Chini Z G, Bassi N, et al. Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low cost photobioreactor[J]. Biotechnol Bioeng, 2009, 102(1): 100-120.

[12]Zhukova N V, Aizdaicher N A. Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae[J]. Phytochemistry, 1995, 39(2): 351-356.

[13]Pistocchi R, Trigari G, Serrazanetti G P, et al. Chemical and biochemical parameters of cultured diatoms and bacteria from the Adriatic Sea as possible biomarkers of mucilage production[J]. Sci Total Environ, 2005, 353: 287-299.

[14]Chuecas L, Riley J P. Component fatty acids of the total lipids of some marine phytoplankton[J]. J Mar Biol Associ UK, 1969, 49: 97-116.

[15]Volkman J K, Jeffrey S W, Nichols P D, et al. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 1989, 128(3): 219-240.

[16]Nichols P D, Palmisano A C, Smith G A, et al. Lipids of the Antarctic sea ice diatomNitzschiacylindrus[J]. Phytochemistry, 1986, 25(7):1649-1753.

[17]Viso A C, Marty J C. Fatty acid from 28 marine microalgae[J]. Phytochemistry, 1993, 34(6): 1521-1533.