戴雪伶， 姜招峰

(北京聯(lián)合大學 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室； 北京聯(lián)合大學 功能食品科學技術(shù)研究院， 北京 100191)

阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease, AD)是一種多發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，年齡是其最主要的風險因素。隨著全球老齡化時代的到來，該病的發(fā)病率將急劇增高，成為威脅社會福利和醫(yī)療制度的一大挑戰(zhàn)[1-2]。根據(jù)阿爾茨海默癥國際組織(Alzheimer′s Disease International, ADI)的年度報告顯示，至2010年全球保守估計約有3560萬人罹患AD，而這一數(shù)字到2050年將增長至1.15億[3]。

AD的主要病理學特征為患者大腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)大量老年斑(Senile plaques, SP)、胞內(nèi)積聚神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFT)以及神經(jīng)元的大量丟失[4]。AD發(fā)病機制目前尚不明確，但β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)有關(guān)學說逐漸占據(jù)主流地位，相關(guān)證據(jù)包括：Aβ聚集形成老年斑斑塊的出現(xiàn)早于AD的臨床癥狀表現(xiàn)；目前所有已知與家族型AD相關(guān)的常染色體突變，如21號染色體上的APP基因、14號染色體上的PS1基因和1號染色體上的PS2基因發(fā)生突變，均能導(dǎo)致Aβ表達增多及沉積的發(fā)生[5]；AD病人腦內(nèi)Aβ42清除能力下降，而腦脊液中Aβ的水平則較正常人低，提示Aβ可在腦組織內(nèi)發(fā)生沉積[6]；AD轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)證實了過量表達Aβ及其發(fā)生聚集沉積形成老年斑與認知能力下降存在因果關(guān)系，并能夠誘導(dǎo)以磷酸化的tau蛋白為主要組分的神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成[7]?；贏β建立的淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié)，可引發(fā)一系列病理過程，這些病理過程又進一步促進Aβ沉積，從而形成一種級聯(lián)式放大效應(yīng)[8-9]。本文擬就淀粉樣蛋白級聯(lián)假說的最新研究進展及阿爾茨海默癥防治的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)是一種廣泛存在的I型跨膜糖蛋白，其成熟過程歷經(jīng)N-, O-糖基化、磷酸化及酪氨酸硫化修飾，幾乎所有哺乳類動物細胞的整個生命過程都可以正常產(chǎn)生APP[10]。成熟的APP將至少可能被3個酶水解切割形成不同片段長度的肽鏈，見圖1。APP在其跨膜的胞外部分被α-分泌酶或β-分泌酶(BACE1，激活位點在腔內(nèi)的跨膜天冬氨酰蛋白酶)切割將產(chǎn)生N端可溶性APP大片段，分別被稱為APPsα或APPsβ，其殘留在細胞膜上的C端APP片段則被稱為CTFα或CTFβ。殘留在膜上的CTFα或CTFβ隨后分別經(jīng)γ-分泌酶(催化位點含有早老素的膜內(nèi)天冬氨酰蛋白酶)水解剪切，形成分子量3 kD的p3片段(非淀粉樣蛋白途徑)或Aβ片段(淀粉樣蛋白途徑)與APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)片段(APP intracellular domain, AICD)。APP的這一水解過程可能發(fā)生于不同器官部位的細胞膜上[9]。

圖1 淀粉樣前體蛋白(APP)水解酶切過程示意圖

Aβ片段一般由38～43個氨基酸殘基所構(gòu)成(以Aβ40或 Aβ42較為常見)，一旦產(chǎn)生，單個Aβ(尤其是Aβ42)傾向于聚集形成聚合物，初始表現(xiàn)為二聚體、三聚體，之后形成寡聚物、原纖維乃至出現(xiàn)在老年斑中的不溶性纖維[11]。Stohr等[12]研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)提取的Aβ不溶性聚集物或化學合成的Aβ所形成的沉積注入小鼠腦內(nèi)后均會導(dǎo)致大范圍的淀粉樣變性發(fā)生，因此推測Aβ沉積具備朊蛋白(一種感染性蛋白質(zhì))的特點即可聚集裝配形成蛋白聚集體。Prusiner甚至提出“與神經(jīng)退行性病變相關(guān)的蛋白均具有類似朊蛋白性質(zhì)”的觀點[13]。

2 β-淀粉樣蛋白的異常聚集與神經(jīng)毒性

APP經(jīng)酶解產(chǎn)生的Aβ經(jīng)過纖維化聚集等過程最終形成AD患者腦內(nèi)的老年斑。正常情況下細胞產(chǎn)生的Aβ是可溶的，幾乎不表現(xiàn)出神經(jīng)毒性；在異常或病理狀態(tài)下，Aβ可經(jīng)過聚集形成致密的不溶性的纖維狀聚集物，在低濃度下即表現(xiàn)神經(jīng)毒性[14]，它能誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡和突觸丟失、誘導(dǎo)機體發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)并打破鈣平衡，其機制可能與其結(jié)合細胞膜有關(guān)[15]。

老年斑是AD的重要病理學特征，主要由Aβ聚集而成，然而研究并未發(fā)現(xiàn)老年斑的數(shù)量與病情的嚴重程度具有明顯的相關(guān)性[16]。研究者最初以纖維狀A(yù)β作為藥物干預(yù)的靶點，然而研究發(fā)現(xiàn)大部分的纖維前體及非纖維狀A(yù)β也具有神經(jīng)毒性，使得AD發(fā)病過程以纖維狀A(yù)β為主導(dǎo)的觀點受到挑戰(zhàn)，人們也因此將注意力逐漸轉(zhuǎn)移至Aβ的折疊及聚集的動態(tài)過程。一般認為成熟Aβ纖維絲的聚集過程是一個依賴于成核反應(yīng)的動態(tài)聚合過程。然而，由于聚集是一個隨機過程，分子在反應(yīng)過程中無法同步化進行，因此在給定時間內(nèi)反應(yīng)體系中都極可能是幾種不同聚集體形式的混合物，即使在聚合反應(yīng)完成后已形成的成熟Aβ纖維絲也未必是長期穩(wěn)定的[17]。另外，反應(yīng)體系成分的復(fù)雜程度還與體系內(nèi)Aβ的濃度、理化參數(shù)如溫度、離子強度和pH值等。

Aβ的存在形式包括可溶性Aβ單體(monomer)、寡聚體(oligomer)和不可溶的Aβ纖維(fibrils)等，這些不同形式的Aβ均能引起神經(jīng)元損傷并損傷記憶功能。其中，可溶性的Aβ寡聚體根據(jù)分子量及形態(tài)的不同分為低分子量聚集體、原纖維、纖維亞單位和ADDLs等[18]。Aβ聚集不是簡單的從單體到纖維的轉(zhuǎn)變，而是一個相對復(fù)雜的過程：經(jīng)原子力顯微鏡觀察，孵育早期的Aβ主要形成5～10 nm的球形顆粒，隨著孵育時間的延長顆粒消失并形成纖維狀結(jié)構(gòu)，這些球形的寡聚體被認為是形成纖維過程中的中間產(chǎn)物[19]。也有人認為可溶性寡聚體和纖維聚集過程可能是互斥的，即有些寡聚體是終末形式，不會再進一步聚集形成纖維結(jié)構(gòu)，而大多數(shù)在形成寡聚體后再繼續(xù)聚集形成纖維，但是導(dǎo)致這兩種聚集路徑的原因還不清楚[18]。部分抑制Aβ聚集的小分子抑制劑僅對寡聚體發(fā)揮作用而其他抑制劑則特異性抑制纖維的形成，表明寡聚體并不是纖維形成過程中必要的中間物，寡聚體和纖維可能是完全不同的聚集過程[20]。

研究表明無論Aβ是否形成纖維狀形態(tài)，均表現(xiàn)出細胞毒性，誘發(fā)神經(jīng)突觸的減少和神經(jīng)元死亡，且寡聚態(tài)Aβ的神經(jīng)毒性強于Aβ纖維[21]。目前研究傾向于認為聚集早期的可溶性Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性最強，能引起神經(jīng)細胞損傷乃至死亡，在AD發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用[14]。然而，用可溶性Aβ的神經(jīng)毒性來解釋毒性效應(yīng)時，還不能完全涵蓋AD更長期的改變，包括神經(jīng)元變性、丟失以及老年斑的產(chǎn)生。老年斑對于神經(jīng)元發(fā)生損傷是必要的，那么是否與老年斑中存在大量的能夠持續(xù)釋放出損傷周圍細胞的Aβ寡聚體有關(guān)？從這個意義上說，老年斑很可能是伴隨著AD發(fā)病而產(chǎn)生，而并非導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷的源頭。

3 靶向Aβ的AD防治策略

美國食品與藥物管理局(FDA)目前已批準用于治療AD的5種藥物包括乙酰膽堿酯酶抑制劑(治療輕中度AD，包括Tacrine、Donepezil、Galantamine、Rivastigmine)和NMDA受體拮抗劑(治療中重度AD，主要為Memantine)，但治療效果均不盡如人意[22]。由于淀粉樣蛋白級聯(lián)假說在目前階段的廣為接受，靶向Aβ生成、聚集及清除等環(huán)節(jié)的藥物研發(fā)逐漸成為近年的研究熱點。

3.1 對Aβ生成的抑制

用藥物干擾APP的加工和酶解過程，減少Aβ過度生成是治療AD的潛在策略之一。APP由β-分泌酶和γ-分泌酶酶切水解形成Aβ，因此找到β-分泌酶或γ-分泌酶的抑制用于早期AD的治療是該領(lǐng)域的主要研究方向[23-24]。早老素1/早老素2是γ-分泌酶的催化亞基，目前發(fā)現(xiàn)的顯性點突變均位于其上，可直接導(dǎo)致Aβ生成量的異常增加。然而，由于γ-分泌酶參與體內(nèi)包括Notch在內(nèi)的多條信號通路，對其抑制將會引起人體的異常反應(yīng)：禮來公司開發(fā)的γ-分泌酶抑制劑semagacestat在III期臨床試驗中由于發(fā)現(xiàn)受試者的認知惡化而被迫停止，其他γ-分泌酶抑制劑如Tarenflurbil和LY451039也由于缺乏特異性等問題而宣告失敗[25]。

β-分泌酶作為APP經(jīng)酶解剪切過程的限速酶，研制針對該酶的抑制劑將是減少Aβ生成的關(guān)鍵。以β-分泌酶為靶點的抑制劑GSK188909目前在體外實驗中證實可減少Aβ40/42的表達，對于轉(zhuǎn)基因動物腦內(nèi)的Aβ表達量也有一定程度的抑制作用[26]。另外，通過誘導(dǎo)APP向α-分泌酶方向進行，從源頭上阻斷Aβ40/42的生成也是目前的研究方向之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些天然活性物質(zhì)也具有減少Aβ生成的作用。雷公藤紅素能夠減少APP在β-分泌酶分裂位點的裂解，相應(yīng)減少了分泌型APP(sAPPβ)和C-末端片段(CTF99)，而雷公藤紅素并不直接影響β-分泌酶的活性，而是通過降低mRNA及蛋白水平的表達量來減少Aβ生成[27]。另有研究使用綠茶提取物EGCG對大鼠灌胃3周后再進行外源性Aβ1-42側(cè)腦室注射，發(fā)現(xiàn)EGCG能夠逆轉(zhuǎn)Aβ1-42所引起的認知障礙，腦組織中α-分泌酶活性升高而β-、γ-分泌酶活性均降低，且腦組織中Aβ的分泌量受到一定程度的抑制[28]。

3.2 抑制Aβ聚集及促進Aβ降解

由于Aβ的聚集過程復(fù)雜，且聚集體的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此抑制Aβ的聚集并盡快啟動清除機制也是一種有效的防治手段[29]。AD患者腦內(nèi)老年斑中富集大量金屬離子，如鋅、銅離子等可通過與Aβ相互作用促進聚集。研究發(fā)現(xiàn)Cu/Zn螯合劑PBT-1在臨床II期試驗中對中重度患者具有較好療效[30]。Ding等[31]研究發(fā)現(xiàn)AD轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)腹腔注射全反式維甲酸8周后，可以有效減少Aβ的聚集，動物額部皮層和海馬區(qū)老年斑的數(shù)量和面積也顯著下降。另有研究表明以香莢蘭乙素(10 mg/kg體重)連續(xù)4個月飼養(yǎng)hAPP(751)SL轉(zhuǎn)基因小鼠能夠顯著降低小鼠腦內(nèi)老年斑的面積，但數(shù)目和區(qū)域比例沒有明顯變化[32]。另外，白藜蘆醇對Aβ的聚集、沉積具有一定的抑制作用，當白藜蘆醇濃度達到100 μM時，可完全抑制 Aβ的聚集[33]。

此外，促進降解也是減輕Aβ毒性的重要途徑之一，體內(nèi)主要的降解酶包括腦啡肽酶(NEP)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等[34]。在AD患者的海馬區(qū)以及大腦皮層可檢測到腦啡肽酶的表達量顯著減少[35]。研究發(fā)現(xiàn)敲除胰島素降解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ生成量顯著增加，而過表達胰島素降解酶及腦啡肽酶的小鼠腦內(nèi)Aβ生成量則顯著下降[36]。

3.3 靶向Aβ的免疫治療

靶向Aβ的免疫治療方法分為主動免疫治療和被動免疫治療。早期研究發(fā)現(xiàn)用Aβ42疫苗接種AD轉(zhuǎn)基因鼠后，可阻止幼年鼠形成淀粉樣的沉積并減輕神經(jīng)性營養(yǎng)不良和星形膠質(zhì)細胞增生[37]。AD患者經(jīng)主動免疫方式多次注射聚集態(tài)Aβ42(AN1792)可減緩患者認知障礙并減少腦脊液中總tau 蛋白含量，但在II期的臨床試驗中發(fā)生嚴重副反應(yīng)，其中6%受試者出現(xiàn)亞急性腦膜炎[38]。后期免疫藥物主要針對被動免疫藥物人源單克隆抗體，其作用機制與天然被動免疫類似。被動免疫是將特異性單克隆抗體直接導(dǎo)入體內(nèi)，進入體內(nèi)的抗體通過兩種主要途徑清除體內(nèi)的Aβ：抗體經(jīng)過血腦屏障進入腦內(nèi)，與老年斑中的Aβ結(jié)合，然后小膠質(zhì)細胞通過Fc受體與抗體的Fc段結(jié)合吞噬分解老年斑；另一條途徑是抗體不進入腦內(nèi)，而與外周血中可溶性的Aβ結(jié)合，打破血腦屏障內(nèi)外Aβ的動態(tài)平衡，促進腦內(nèi)的Aβ加強外流從而降低腦內(nèi)的Aβ水平。

將單抗m266經(jīng)靜脈注射至PADPP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，注射到外周血中的m266促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的Aβ從腦內(nèi)流動到外周血中，起到了一個外周降解的作用阻止了Aβ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積[39]。研究表明經(jīng)Aβ免疫治療后受試者的認知功能明顯改善，PET成像結(jié)果顯示淀粉樣斑塊減少，但副反應(yīng)仍然是目前免疫療法的主要問題[40]，主動或被動免疫均可引起局部腦出血、血管源性水腫及血管附近淀粉樣沉淀增加等副反應(yīng)[41-42]。

4 AD治療前景及展望

以Aβ為治療靶向的根本，是從Aβ的生成、聚集等途徑來減少Aβ，減少淀粉樣斑塊的沉積，改善患者的認知障礙。目前根據(jù)這一方案所研制的藥物，雖然在動物模型上取得了較顯著的療效，但是大部分因為不同程度的副反應(yīng)或進入臨床試驗后效果不佳宣告失敗，迄今未研制出切實有效的AD治療藥物。由于臨床試驗治療對象主要是AD中后期患者，這一階段神經(jīng)元功能已經(jīng)嚴重損傷，此時很難逆轉(zhuǎn)疾病進程，也是眾多AD藥物在臨床試驗失敗的主要原因。因此，重視AD早期的診斷與干預(yù)研究，或許更容易找到AD藥物治療的突破口。生物活性化合物以其毒副作用小，容易獲得及生物相容性好等特點已受到越來越多的關(guān)注，大量研究資料表明其在抑制Aβ的生成、聚集及減輕神經(jīng)毒性方面發(fā)揮重要作用[43]。重視對天然活性物質(zhì)的開發(fā)，有望改變目前的局面，研制出延緩AD發(fā)生和發(fā)展的有效藥物。

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