蔡小東，曹文娟 （長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

核桃 （Juglans）為落葉喬木，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都較高的堅(jiān)果和木本油料樹(shù)種，也是常見(jiàn)的園林綠化樹(shù)種之一。然而，常規(guī)繁殖技術(shù)制約了核桃良種的推廣。核桃實(shí)生繁殖童期較長(zhǎng)且因天然雜交易產(chǎn)生變異，葉片或枝條扦插繁殖存在生根困難的問(wèn)題，嫁接繁殖又因核桃內(nèi)含較多的酚類(lèi)物質(zhì)，嫁接成活率往往很低［1］。植物離體培養(yǎng)技術(shù)為核桃良種快速繁殖和生物技術(shù)育種提供了一條新途徑，盡管核桃屬植物是公認(rèn)的較難離體培養(yǎng)的植物之一，但仍然受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［2－10］。筆者綜述了外植體基因型、培養(yǎng)基成分 （生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、基本培養(yǎng)基、凝固劑及培養(yǎng)基添加物）、外植體來(lái)源及光照條件對(duì)核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響，介紹了核桃愈傷組織懸浮系建立及分化培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀，并展望了愈傷組織在核桃生物技術(shù)中的應(yīng)用。

1 核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素

從理論上講，幾乎所有高等植物的各種器官或組織在適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及適宜濃度等條件下離體培養(yǎng)，都能產(chǎn)生愈傷組織。然而，愈傷組織的形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受外植體基因型、培養(yǎng)基成分、外植體來(lái)源、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、凝固劑、培養(yǎng)基添加物及光照條件等諸多因素之間相互作用的影響。

1.1 基因型

基因型對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有決定性的影響。核桃屬是木本植物中較難離體培養(yǎng)的樹(shù)種之一，目前愈傷組織誘導(dǎo)方面的報(bào)道僅集中在核桃 （J.regia）和黑核桃 （J.nigra）2個(gè)種中。不僅如此，不同品種的核桃在愈傷組織誘導(dǎo)率方面也存在差異。如Farsi等 （2012）發(fā)現(xiàn)在同等光照及培養(yǎng)基條件下，‘Chandler’核桃愈傷誘導(dǎo)率均顯著低于 ‘Hartley’核桃。

1.2 外植體來(lái)源

所有外植體都有誘導(dǎo)愈傷組織成功的潛在可能性。前人研究表明核桃可以從實(shí)生苗或組培苗葉片、莖尖、葉柄、葉脈以及成熟或未成熟胚、子葉、胚軸等不同部位誘導(dǎo)出愈傷組織。一般而言，核桃幼胚及其組分愈傷組織誘導(dǎo)率高于葉片葉片、莖尖、葉柄、葉脈。方宏筠等［3］以黑核桃的幼胚和幼葉為外植體，發(fā)現(xiàn)幼葉的愈傷組織誘導(dǎo)率 （15.4%）明顯低于幼胚 （67.7%）。在一些研究中，核桃體胚發(fā)生往往伴隨著愈傷組織的出現(xiàn)。湯浩茹［7］以3個(gè)德國(guó)主栽優(yōu)良核桃品種不同發(fā)育時(shí)期的胚珠、胚軸與子葉以及試管苗葉片、葉柄和莖段為試材，研究了核桃的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)在MS與DKW上的子葉75%以上形成了大量淡黃色愈傷組織。Payghamzadeh等［8］在用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理核桃幼胚時(shí)，發(fā)現(xiàn)除了幼胚萌芽、根和芽的增殖外，還有愈傷組織的形成。植物胚乳培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)有愈傷組織的形成，在核桃胚乳離體培養(yǎng)再生三倍體植株的過(guò)程中，也有愈傷組織的出現(xiàn)［9］。不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量也有很大差異。劉淑蘭等［10］研究發(fā)現(xiàn)從核桃莖尖、葉柄及葉脈等不同部位均可誘導(dǎo)愈傷組織，但是愈傷組織質(zhì)地和顏色不同，只有莖尖愈傷組織則表現(xiàn)為松散乳白色，在光下培養(yǎng)不轉(zhuǎn)綠，這種愈傷組織可長(zhǎng)期維持分裂能力。不僅如此，外植體取材時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率及其質(zhì)量也有較大影響。Neuman等［11］研究發(fā)現(xiàn)，黑核桃花后10、12及14周的子葉誘導(dǎo)獲得的愈傷組織體積最大，干重也最大。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)、含量及組成比例是調(diào)控外植體產(chǎn)生愈傷組織的主導(dǎo)因素。Heile－Sudholt等［12］以黑核桃的胚軸和實(shí)生苗莖尖為外植體，發(fā)現(xiàn)6－BA的濃度對(duì)胚根、上胚軸、不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)影響很大，6－BA能刺激愈傷組織的形成。Payghamzadeh等［8］認(rèn)為生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素在核桃愈傷組織中有至關(guān)重要的作用，其中BAP和IBA的濃度決定了愈傷組織的鮮重，0.01mg／L或0.1mg／L IBA和1.5mg／L BAP的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合有利于從核桃未成熟胚或子葉中誘導(dǎo)愈傷組織，并且再生的是淡黃色或白色的疏松愈傷組織，但是這些愈傷組織生長(zhǎng)慢。冀愛(ài)青等［13］用正交設(shè)計(jì)法研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)核桃子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響核桃子葉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素大小為6－BA＞KT＞IBA。不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的質(zhì)地及顏色也有影響。在含2，4－D的培養(yǎng)基上，F(xiàn)ernández等［14］發(fā)現(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)的愈傷組織呈綠色瘤狀，而在添加NAA或IBA的培養(yǎng)基上，由于花色素的存在，愈傷組織則呈紅色或粉紅色，且在含有2，4－D的培養(yǎng)基上愈傷組織鮮重比在添加NAA或IBA的培養(yǎng)基上的低。

1.3.2 基本培養(yǎng)基

目前國(guó)際上流行的植物培養(yǎng)基有幾十種。DKW是核桃葉片培養(yǎng)、莖段培養(yǎng)、胚培養(yǎng)及體胚誘導(dǎo)的首選培養(yǎng)基，但也有人認(rèn)為DKW 并不適于黑核桃的體胚誘導(dǎo)［11，15］。Avilés等［16］研究了BTM、MS、DKW及WPM 4種基本培養(yǎng)基對(duì)成年核桃葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4種培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率并沒(méi)有顯著差異，但是在BTM培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基上瘤狀愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于其他2種培養(yǎng)基，且在BTW培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)較好。Farsi等［6］發(fā)現(xiàn)NN和MS培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率及褐化有很大影響，培養(yǎng)第6周，‘Hartley’核桃黑暗或低光強(qiáng)培養(yǎng)在NN培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率最高，‘Chandler’核桃低光照培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上或改良光照條件下培養(yǎng)在NN培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率最低；在MS培養(yǎng)基上，‘Chandler’核桃在黑暗或低光照條件下褐化較嚴(yán)重。

1.3.3 凝固劑及培養(yǎng)基添加物

不同類(lèi)型凝固劑所含的成分、純度和物理性能都存在差異，影響培養(yǎng)基的物理結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用，從而影響外植體的生長(zhǎng)發(fā)育。Gelrite透明度較瓊脂高，凝固溫度低且透氣性好，含Ca、Mg雜質(zhì)也少，Cornu等［17］認(rèn)為Gelrite促進(jìn)了核桃愈傷組織的形成。Phytagel也是一種新型的培養(yǎng)基固化劑，具有一定的防褐化作用，能提高胚性愈傷組織增殖速度、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生頻率。在核桃愈傷組織誘導(dǎo)中，通常在培養(yǎng)基中添加2.1～2.5g／L Phytagel來(lái)促進(jìn)愈傷組織的形成［6，16］。

在培養(yǎng)基中添加有機(jī)附加物，如甘氨酸、水解酪蛋白、酵母汁、椰汁、土豆汁及馬鈴薯提取液等，可促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)發(fā)育。在核桃的離體培養(yǎng)中，也常常通過(guò)在培養(yǎng)基中添加一些有機(jī)附加物來(lái)促進(jìn)外植體的分化或脫分化，其中甘氨酸和水解酪蛋白是在進(jìn)行體胚發(fā)生或愈傷組織誘導(dǎo)中常用的培養(yǎng)基添加物［5，8，11］。

1.4 培養(yǎng)條件

光照條件也是影響核桃愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的重要因素之一。張燕等［18］發(fā)現(xiàn)較弱光照下核桃愈傷組織顏色呈現(xiàn)黃綠色、淡黃色等，而在黑暗條件下愈傷組織呈白色，但是褐變現(xiàn)象嚴(yán)重。

當(dāng)然，核桃愈傷組織的誘導(dǎo)率，愈傷組織的生長(zhǎng)量，質(zhì)地顏色是受上述因素綜合影響的。Farsi等［6］以成熟核桃樹(shù)莖段離體繁殖的葉片為外植體，以添加不同濃度的BA和NAA的MS和NN作為培養(yǎng)基，采用黑暗，低光強(qiáng)及改良光強(qiáng) （第一月培養(yǎng)在黑暗條件下，隨后采用低光強(qiáng)培養(yǎng)）3個(gè)光照培養(yǎng)條件，探討了核桃品種、培養(yǎng)基、光照條件對(duì)葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響。結(jié)果在3種光強(qiáng)處理下大部分再生的愈傷是疏松的非胚性愈傷組織，但愈傷誘導(dǎo)率與品種、培養(yǎng)基、光照條件及它們間的互作有關(guān)。就目前研究現(xiàn)狀而言，這些因素在核桃愈傷組織誘導(dǎo)中的互作仍需更深入的研究。

2 愈傷組織懸浮系的建立

優(yōu)良的愈傷組織懸浮系是開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體操作的基礎(chǔ)之一。有關(guān)核桃愈傷組織懸浮培養(yǎng)的研究報(bào)道很少。袁巧平等［2］用核桃的幼胚作外植體，在子葉部位形成胚性愈傷組織，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織在懸浮振蕩培養(yǎng)中可保持分生能力。Rodríguez等［19］以核桃成熟胚為外植體，獲得了愈傷組織并初步建立了愈傷組織懸浮系。然而，有關(guān)這些懸浮系的利用并沒(méi)有后續(xù)報(bào)道。

3 分化培養(yǎng)

愈傷組織可以通過(guò)胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑再生植株。然而，從核桃不同部位誘導(dǎo)的愈傷組織很容易褐化死亡，很難長(zhǎng)期保存，愈傷組織分化培養(yǎng)也較困難［5］。但也有一些愈傷組織再生根、芽甚至胚狀體的報(bào)道。湯浩茹［7］研究發(fā)現(xiàn)核桃愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)能再生根，但未誘導(dǎo)出芽。張燕等［18］從核桃葉片誘導(dǎo)出愈傷組織的經(jīng)不同激素組合誘導(dǎo)，再生了芽。方宏筠等［3］發(fā)現(xiàn)黑核桃胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，部分胚性愈傷組織生長(zhǎng)受到抑制并逐漸萎縮死亡，但有些胚性愈傷組織能夠分化發(fā)育產(chǎn)生胚狀體。Fernández等［14］將NAA或IBA誘導(dǎo)的愈傷組織在含有NAA或IBA的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系具有體胚發(fā)生能力。然而，目前還沒(méi)有核桃愈傷組織最終分化成苗的報(bào)道。

4 展望

我國(guó)核桃資源豐富，分布范圍廣，遺傳類(lèi)型多樣。現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為核桃育種提供了新的方法，有望克服常規(guī)育種中遇到的各種問(wèn)題。愈傷組織是種質(zhì)資源保存、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體相關(guān)操作以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究的理想起始材料。誘導(dǎo)核桃胚性愈傷組織特別是胚性愈傷組織是開(kāi)展核桃生物技術(shù)及相關(guān)研究的基礎(chǔ)［20］，研究核桃愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及分化培養(yǎng)有重要的理論和實(shí)踐意義。目前，核桃愈傷組織培養(yǎng)還沒(méi)有形成完整的體系。因此，核桃愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、懸浮系建立、分化培養(yǎng)需要更深入的研究。

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