范 源， 趙江盛， 徐志平， 張建博， 林 青

(1.云南中醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 2.龍潤集團(tuán)愛尼食品廠， 云南 昆明 650100)

余甘子(Phyllanthus emblica)是大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(Phyllanthus)的一種生長在中國亞熱帶、熱帶部分地區(qū)，特別是干熱河谷地區(qū)的落葉喬木或灌木資源植物[1]。余甘子因其具有抗氧化、抗衰老、防癌癥、抗心血管病、治糖尿病等多種保健與治療的作用而廣泛應(yīng)用[2-5]。余甘子果實(shí)在貯運(yùn)中易發(fā)生褐變對(duì)其保存與加工及產(chǎn)品的穩(wěn)定性均有較大的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 余甘子果實(shí)：本文采用對(duì)云南瀾滄江、金沙江、元江流域的7個(gè)縣同時(shí)采集獲得的余甘子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸含量測(cè)定方法

1.2.1.1 儀器與試劑 Agilent1100(VWD檢測(cè)器)、甲醇(色譜純)、磷酸、純化水、沒食子酸對(duì)照品(購自云南省藥檢所)含量98%。

1.2.1.2 測(cè)定方法 以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以甲醇-0.2%磷酸溶液(5：95)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為273 nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。對(duì)照品制備：取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液。供試品制備：取約200 g橄欖果實(shí)榨汁后，稱取原果汁約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算。

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

1.2.2.1 儀器與試劑 紫外-可見分光光度計(jì)：島津UV2450、精密酸度計(jì)(0.01 pH)、離心機(jī)、10 mL比色管、10 mL離心管、玻璃乳缽、A液：pH 8.20的0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(內(nèi)含1 mmol/L EDTA 2Na)、B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液、10 mmol/L鹽酸溶液、蒸餾水。

1.2.2.2 測(cè)定方法 (1)在25℃左右，于10 mL比色管中依次加入A液2.35 mL，蒸餾水2.00 mL，B液0.15 mL，加入B液立即混合并傾入比色皿，分別測(cè)定在325 nm波長條件下初始時(shí)和1 min后吸光值，二者之差即鄰苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。本試驗(yàn)確定ΔA325(min-1)為0.060。(2)樣液和SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定按步驟1分別加入一定量樣液或酶液使抑制鄰苯三酚自氧化速率約為1/2ΔA325(min-1)，即ΔA325(min-1)為0.030。

(公式1)

1.2.3 抗壞血酸(維生素C)含量的測(cè)定

1.2.3.1 儀器與試劑 恒溫箱：(37±0.5)℃、可見-紫外分光光度儀：島津(UV2450)、搗碎機(jī)、4.5mol/L硫酸、85%硫酸、2，4-二硝基苯肼溶液(20 g/L)、草酸溶液(20 g/L)、草酸溶液(10 g/L)、硫脲溶液(10 g/L)、硫脲溶液(20 g/L)、1 mol/L鹽酸、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取100 mg純抗壞血酸溶解于100 mL濃度為10 g/L草酸溶液中，此溶液每毫升相當(dāng)于1mg抗壞血酸、活性炭：將100 g活性炭加到750 mL濃度為1 mol/L的鹽酸中，回流1～2 h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子(Fe3+)為止，然后置于110℃烘箱中烘干。

1.2.3.2 測(cè)定方法 在避光的條件下，稱取100 g鮮余甘子果肉及吸取100 mL濃度為20 g/L草酸溶液，倒入搗碎機(jī)中打成勻漿，取0.2 g～1 g勻漿(含1 mg～2 mg抗壞血酸)倒入100 mL容量瓶中，用10 g/L草酸溶液稀釋至刻度，混勻；過濾取25 mL濾液，加入2 g活性炭，振搖1 min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10 mL此氧化提取液，加入10 mL濃度為20 g/L硫脲溶液，混勻，此試樣定為稀釋液。

呈色反應(yīng)：于三個(gè)試管中各加入4 mL稀釋液。一個(gè)試管作為空白，在其余試管中加入1.0 mL濃度為20 g/L的2、4-二硝基苯肼溶液，再將所有試管放入(37±0.5)℃恒溫箱或水浴中，保溫3h后取出，除空白管外將所有試管放入冰水中。空白管取出使其變?yōu)槭覝?，然后加?.0 mL濃度為20 g/L的2、4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置10 min～15 min后放入冰水內(nèi)。其它步驟同其余3個(gè)試樣。當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管加入85%硫酸5 mL，后將試管自冰水中取出，在室溫放置30 min后比色。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：加2 g活性炭于50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中，振搖1 min，過濾，取10 mL濾液放入500 mL容量瓶中，加5.0 g硫脲，用10 g/L草酸溶液稀釋至刻度、抗壞血酸(20 μg/mL)，取5，10，20，25，40，50，60 mL稀釋液，分別放入7個(gè)100 mL容量瓶中，用10 g/L硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，5，8，10，12 μg/mL，按試樣測(cè)定步驟形成脎并比色，以吸光值為縱坐標(biāo)，抗壞血酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(公式2)

式中：X——試樣中總抗壞血酸含量，單位為毫克每百克(mg/100 g)。c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得“試樣氧化液”中總抗壞血酸的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)。V——試樣用10 g/L草酸溶液定容的體積，單位為毫升(mL)。F——試樣氧化處理過程中的稀釋倍數(shù)。m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果表示小數(shù)點(diǎn)后兩位。

2 結(jié)果與分析

7個(gè)不同產(chǎn)地的余甘子儲(chǔ)藏前與儲(chǔ)藏中相比，其沒食子酸的含量變化均上升(見表1)；不同產(chǎn)地余甘子儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏中比較，含維生素C量變化有5例呈上升趨勢(shì)，2例呈下降趨勢(shì)(見表2)；余甘子中SOD在不同產(chǎn)地儲(chǔ)存前及儲(chǔ)存中的活性變化在表中可以看出有5例活性減弱，2例活性增強(qiáng)(見表3)；結(jié)果顯示，在余甘子儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏中，與維生素C和SOD的變化相比，在余甘子儲(chǔ)藏中，沒食子酸含量上升的比例最為明顯(見表1～3及圖1)。

表1 滇橄欖不同產(chǎn)地儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏中沒食子酸含量的變化

表2 滇橄欖不同產(chǎn)地儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏中維生素C含量的變化

表3 余甘子不同產(chǎn)地儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏中SOD活性的變化

圖與儲(chǔ)存前相比儲(chǔ)存中沒食子酸含量變化的比率

沒食子酸含量增多，可能因?yàn)椴烧蟀l(fā)生呼吸躍變[5]，膜透性降低，果實(shí)多酚化合物與氧結(jié)合，導(dǎo)致余甘子中復(fù)雜的多酚化合物如單寧酸、五沒食子?；咸烟?、槲皮素、糅花酸等發(fā)生分解反應(yīng)使沒食子酸從這些化合物中解離、脫落，致使沒食子酸增多，并發(fā)生褐變[7～9]；Vc含量多為減少趨勢(shì)，可能因?yàn)楣麑?shí)采摘后呼吸鏈發(fā)生斷裂等環(huán)境變化導(dǎo)致Vc降解反應(yīng)使其含量降低，或發(fā)生非酶褐變從而導(dǎo)致Vc含量的下降[10]；SOD活性多為降低的現(xiàn)象可能是采摘后呼吸鏈斷裂使果實(shí)內(nèi)部成分發(fā)生變化致使有機(jī)酸濃度升高、pH下降導(dǎo)致銅鋅氧化酶銅離子解離、PPO逐漸失活引起SOD失活等，當(dāng)采摘后由于褐變等一系列變化導(dǎo)致酶類分解，SOD活性降低[11]。部分余甘子采摘后SOD活性增高，可能是由于當(dāng)?shù)丨h(huán)境脅迫導(dǎo)致果實(shí)中產(chǎn)生大量的ROS的積累促使SOD活性增加。

3 結(jié)論

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出：不同產(chǎn)地余甘子中的沒食子酸、維生素C、SOD等活性成分在貯藏中會(huì)發(fā)生變化，其中沒食子酸含量變化尤為突出，可以考慮將沒食子酸作為余甘子早期褐變的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。研究并分析余甘子貯藏中活性產(chǎn)物含量及變化對(duì)余甘子等果實(shí)類中藥的貯藏及養(yǎng)護(hù)有較高價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡英娜.我國余甘子種植資源與開發(fā)利用研究的進(jìn)展[J].福建果樹，2000，01：2007～2010.

[2]聶東，馬驍，田徽.余甘子果實(shí)化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，11(31)：61-66.

[3]王飛.余甘子抗癌化學(xué)物質(zhì)組分及作用機(jī)制研究[D].中國遼寧.遼寧中醫(yī)藥大學(xué).2011.

[4]胡煒.余甘子提取物對(duì)糖尿病大鼠肌肉和脂肪組織胰島素信號(hào)通路的影響[J].中國組織工程研究.2012，11：2007-2010.

[5]王輝.余甘子的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥.2011，13(11)：52-56.

[6]林河通，陳蓮，陳紹軍，等.橄欖果實(shí)采后生物學(xué)研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào).2005，31(4)：464-469.

[7]張楚晗，梁曉，龔力民，等.五倍子中單寧酸轉(zhuǎn)化為沒食子酸的酶法實(shí)驗(yàn)探討[C].第三屆中國中藥商品學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆中藥葛根國際產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會(huì)論文集.2012.

[8]邱棟梁，劉星輝.果肉褐變機(jī)理[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1998，27(01)：37-41.

[9]孔祥佳，林河通，陳雅平，等.低溫儲(chǔ)藏對(duì)“長營”橄欖果實(shí)采后生理和品質(zhì)的影響[J].包裝與食品機(jī)械.2011，29(02)：1-5.

[10]鄧啟輝，余愛農(nóng).二階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定非酶褐變反應(yīng)中抗壞血酸的含量[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào).2010，28(02)：194-198.

[11]竇俊輝，喻樹迅，范術(shù)麗，等.SOD與植物脅迫抗性[J].分子植物育種.2010，8(02)：359-364.