李守淳黃 靜,虞功亮李仁輝

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430027)

鄱陽湖的中國水華藍(lán)藻新記錄屬—?dú)饨z藻屬

李守淳1黃 靜1,2虞功亮2李仁輝2

(1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330022; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430027)

2012年4月和10月在江西省鄱陽湖進(jìn)行野外調(diào)查時, 發(fā)現(xiàn)一種浮游的絲狀藍(lán)藻。通過分離純培養(yǎng), 獲得了6個純化藻株。根據(jù)藻株主要形態(tài)學(xué)特征及其16S rRNA基因序列與比較, 鄱陽湖這些藻株與老撾的2株Aerosakkonema funiforme較為相近, 其中16S rRNA基因序列的相似度達(dá)到98%。鑒于這些藻株不同于顫藻目中其他屬的藻株, 因此確定為我國一水華藍(lán)藻新記錄屬——?dú)饨z藻屬Aerosakkonema Nanda & Watanabe 2012, 模式種為索狀氣絲藻Aerosakkonema funiforme Nanda & Watanabe 2012。

氣絲藻屬; 索狀氣絲藻; 絲狀藍(lán)藻; 水華; 鄱陽湖

近年來, 隨著人類活動和社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展,水環(huán)境污染加劇, 湖泊水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重, 繼而引起藻類水華暴發(fā), 已成為典型的生態(tài)問題[1]。藻類水華不僅嚴(yán)重污染水體景觀, 還會釋放出藻毒素和異味物質(zhì)等嚴(yán)重威脅水體本身及水生生物, 甚至周邊生活的動物和人類的健康[2]。迄今已報道有上百種藍(lán)藻可形成水華[3], 其中微囊藻 Microcystis Kützing、魚腥藻 Anabaena Bory、束絲藻 Aphanizomenon Morren和節(jié)球藻Nodularia Mertens為常見的可產(chǎn)生藻毒素的水華種類。由于微囊藻水華發(fā)生的范圍規(guī)模最大, 頻率最高, 毒性強(qiáng), 影響大, 故研究報道最多, 而對其他絲狀水華藍(lán)藻較少, 特別是無異形胞分化的顫藻類(Oscillatorialean)研究得更少[2]。

Anagnostidis和Komárek[4]于1988年將顫藻屬Oscillatoria Vaucher ex Gomont內(nèi)具氣囊的大部分浮游種類重新劃分為一個新屬浮絲藻屬(Planktothrix)。2002年Suda等[5]根據(jù)形態(tài)、脂肪酸成分和16S rDNA序列等多種特征將具氣囊的浮游性淡水顫藻劃分為浮絲藻屬(Planktothrix)和擬浮絲藻屬 (Planktothricoides)。氣絲藻屬Aerosakkonema Nanda & Watanabe是Nanda等[6]2012年根據(jù)形態(tài)、脂肪酸成分、16S rDNA序列及細(xì)胞內(nèi)氣囊結(jié)構(gòu)GvpA蛋白質(zhì)序列等多種特征將其從顫藻屬中分離出來的, 并以索狀氣絲藻Aerosakkonema funiforme Nanda & Watanabe作為模式種的新屬。

最近, 在江西省鄱陽湖進(jìn)行藍(lán)藻水華多樣性調(diào)查時發(fā)現(xiàn)該物種的存在, 為我國水華藍(lán)藻的新記錄屬種, 也是我國水華藍(lán)藻的新記錄屬——?dú)饨z藻屬Aerosakkonema。據(jù)此, 本文通過形態(tài)和分子生物學(xué)研究進(jìn)一步觀察, 描述并首次報道了該物種的中國藻株的分類學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

在江西省鄱陽湖的都昌至星子水域, 用25號篩絹制作的浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)目64 μm)采集水體表層中的浮游性藻類。采集地環(huán)境數(shù)據(jù): 水溫(20—23)℃,透明度(10—60) cm, pH 7.33—8.17, 溶解氧(3.87—8.96) mg/L。

1.2 藻種分離

采用經(jīng)典的毛細(xì)管分離法[7]: 將巴斯德吸管制作成毛細(xì)管(Pasteur Micropipette)在解剖鏡下挑取單根藻絲, 使用無菌純水清洗7—8次, 最后放入含有5 mL CT培養(yǎng)基[8]的試管中培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度(25+1)℃,光強(qiáng)25 μE/(m2·s), 光暗周期為12︰12, 3周后便可得到單克隆藻種。純化后的藻種保存在中國科學(xué)院水生生物研究所有害藻類生物學(xué)組的藻種庫, 編號分別為: CHAB5106、CHAB5107、CHAB5112、CHAB5138、CHAB5170、CHAB5177。

1.3 形態(tài)觀察和測量

藻絲形態(tài)的觀察使用Olympus BX51 型光學(xué)顯微鏡, 外接500萬像素的數(shù)碼相機(jī)(QIMAGING Micropublish 5.0 RTV)和臺式計算機(jī)。數(shù)碼拍照和數(shù)據(jù)測量通過其附帶的圖像分析軟件Image-pro express 5.1控制和實行。選取50個以上的藻體進(jìn)行各項數(shù)據(jù)的測量統(tǒng)計。

1.4 16S rRNA基因序列測定和分子系統(tǒng)分析

藻株培養(yǎng)、細(xì)胞富集、藻細(xì)胞DNA的提取方法參照王捷的描述[9]。16S rDNA擴(kuò)增引物為F1和1492[10,11], 均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 包含1.5 mmol/L MgCl2; 200 mmol/L dNTP; 10 pmol引物; 1×buffer PCR 緩沖液; 1 U TaqDNA聚合酶(Takara, Japan)。擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸50s, 35個循環(huán); 72℃延伸10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳, EB 染色, 在2F-90型暗箱式紫外透射儀下檢測。PCR 測序由北京華大基因科技有限公司進(jìn)行正、反向測序, 將測序得到的序列整理拼接后, 用BioEdit軟件對測得的基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行多序列對齊排列。運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.2 中的Kimura2-parameter 模型計算各序列間的距離和序列相似性等等, 采用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建鄰接法關(guān)系樹, 空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對刪除(Pairwise deletion)處理。使用PHYLIP軟件構(gòu)建最大簡約(Maximum parsimony, MP)樹, 結(jié)合MrMTgui和Modeltest3.7 軟件, 估算出數(shù)據(jù)集最優(yōu)模型: TrN+I+G。在PAUP4.0 軟件中, 利用最優(yōu)數(shù)據(jù)模型構(gòu)建最大似然法(Maximum likelihood, ML)樹。采用自舉檢驗(Bootstrap)估計系統(tǒng)樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度, 自展數(shù)據(jù)集為1000, 以Gloeobacter violaceus PCC 7421為外類群。

1.5 藻膽蛋白的提取及光譜分析

將培養(yǎng)好的藻液以5000 r/min離心15min, 棄上清液, 得到藻體。然后將藻體用蒸餾水洗滌兩次, 離心(5000 r/min, 10min)后富集藻體[14]。取少量藻體以蒸餾水作空白, 測藻株的活體吸收光譜; 取較多藻體加入少量10 mmol/L (pH 6.8)的磷酸緩沖液并用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞, 然后–20℃下冷凍 30min, 迅速解凍, 此過程反復(fù) 2—3次, 離心(12000 r/min, 20min), 將上清液轉(zhuǎn)至超高速離心機(jī)(OptimaTM MAX-XP)中繼續(xù)離心(80000×g, 1h), 收集上清液[13]。用島津uv-2550型分光光度計在(400—750 nm)范圍內(nèi)測定藻株的活體吸收光譜及吸收光譜。藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)和葉綠素a的激發(fā)波長分別為620、650和680 nm。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)分析

氣絲藻屬Aerosakkonema Nanda & Watanabe 2012 植物體為單生藻絲或由許多藻絲組成自由漂浮的松散群體。藻絲直或略彎曲, 有時折疊, 藍(lán)綠色或橄欖綠色。橫壁收縊, 末端細(xì)胞不漸尖細(xì)。培養(yǎng)狀態(tài)下偶爾可見很薄的鞘。內(nèi)囊體排列不規(guī)則。以藻殖段進(jìn)行繁殖。

圖1 鄱陽湖分離的索狀氣絲藻的形態(tài)特征圖(圖例均為20 μm)Fig. 1 The morphological characterization of Aerosakkonema funiforme strains isolated from Poyang lake, China (All bars representing 20 μm)

分類地位: 藍(lán)藻門(Cyanophyta), 藍(lán)藻綱(Cyanophyceae), 顫藻目(Oscillatoriales), 席藻科(Phormidiaceae)。

索狀氣絲藻Aerosakkonema funiforme Nanda & Watanabe 2012 (圖1) 藻絲單生或多數(shù)聚集成松散群體, 自由漂浮。藻絲直或稍微彎曲, 有時折疊,藍(lán)綠色或橄欖綠色, 偶爾可見擰成一束, 橫壁收縊,末端不尖細(xì), 鈍圓, 無帽狀結(jié)構(gòu), 具透明的薄鞘。細(xì)胞盤狀, 細(xì)胞長(2.1—4.1) μm, 寬(11.2—15.1) μm。氣囊小且分散在細(xì)胞內(nèi), 無偽分枝、不含異形胞和厚壁孢子。以藻殖段進(jìn)行繁殖。

從細(xì)胞大小上看, 本文中的索狀氣絲藻與Nanda等[6]描述的略小一點(diǎn), 其他的形態(tài)特點(diǎn)均相似。

分布: 江西省鄱陽湖, 老撾Nam Ngum水庫。

2.2 分子系統(tǒng)分析

利用上述引物擴(kuò)增藻株的 16S rRNA基因, 均得到較亮的電泳條帶, 進(jìn)一步測序獲得長度為 1444 bp序列。通過 Blast 比對和基于 16S rDNA序列的NJ/MP/ML 系統(tǒng)樹的構(gòu)建, 可看出從鄱陽湖分離的6株藻株同兩株老撾的索狀氣絲藻(A.funiforme Lao26和A. funiforme Lao35 )相似度很高(都達(dá)到了98%的相似度), 從而聚集在一起(圖2)。

圖2 基于16S rRNA基因序列的絲狀藍(lán)藻的NJ/MP/ML分子系統(tǒng)樹Fig. 2 Phylogenetic tree (NJ/MP/ML) of filamentous cyanobacteria based on 16S rDNA sequences

2.3 藻膽蛋白的光譜分析

索狀氣絲藻活細(xì)胞的吸收光譜如圖3所示?？梢钥闯鲇?個明顯的吸收峰, 430 nm和678 nm為葉綠素a的吸收峰, 620 nm為藻藍(lán)蛋白(PC)的吸收峰。而560 nm左右代表藻紅蛋白(PE)的吸收峰并沒有出現(xiàn)。

圖3 索狀氣絲藻的活體吸收光譜Fig. 3 In vivo absorption spectrum of Aerosakkonema funiforme.

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 對非異形胞分化的絲狀藍(lán)藻顫藻目(Oscillatoriales)的分類變化和調(diào)整很大[4]。典型例子為顫藻屬(Oscillatoria)的分類修訂調(diào)整。Nanda等[6]于2012年從顫藻屬中分離并建立了氣絲藻屬(Aerosakkonema), 其模式種為索狀氣絲藻Aerosakkonema funiforme, 藻株分離于老撾Nam Ngum水庫。Nanda等[6]研究表明, Aerosakkonema的16S rDNA序列與無偽空泡藻株P(guān)hormidium sp. KS相似性最高, 為93.8%(相似性低于94.6%即為不同的屬[12])。其營養(yǎng)細(xì)胞大小, 細(xì)胞內(nèi)類囊體的形狀和排列也與Phormidium有明顯的差異; Aerosakkonema與有氣囊淡水顫藻類藻株, 如Planktothrix, Planktothricoides和Limnothrix在形態(tài)方面存在區(qū)別, 內(nèi)囊體不規(guī)則排列、營養(yǎng)細(xì)胞盤狀、細(xì)胞更寬、藻株培養(yǎng)時可長達(dá)至23 mm, 有時藻絲可擰成一束成繩狀,此現(xiàn)象在有氣囊淡水顫藻類中首次報道; GvpA蛋白質(zhì)序列和電鏡均顯示含有氣囊, 其形狀排列區(qū)別于Planktothrix, Planktothricoides和Limnothrix, 且無藻紅蛋白(PE)。

本研究顯示, 從形態(tài)上, 鄱陽湖分離的藻株營養(yǎng)細(xì)胞長(2.1—4.1) μm, 寬(11.2—15.1) μm, 比 Planktothrix的細(xì)胞大。吳忠興等[2]報道Planktothricoides營養(yǎng)細(xì)胞長(3—8) μm, 寬(9—16) μm, 藻絲末端漸細(xì), 近頂端略彎。本研究的藻株的細(xì)胞大小范圍雖與其有重疊, 但末端細(xì)胞鈍圓, 無帽狀結(jié)構(gòu),存在明顯區(qū)別; 藻株培養(yǎng)生長后具有明顯的鞘, 更接近Lyngbya[4], 與Lyngbya hieronymusii var. hieronymusii[13]相比營養(yǎng)細(xì)胞更大, 而與老撾藻株(Lao26和Lao38)相比營養(yǎng)細(xì)胞略小, 其他的形態(tài)特點(diǎn)均相似。藻膽蛋白吸收光譜顯示分離藻株只有藻藍(lán)蛋白(PC)和別藻藍(lán)蛋白(APC), 但Lyngbya hieronymusii var. hieronymusii[13]還含有藻紅蛋白(PE), 因此可初步鑒定為索狀氣絲藻; 16S rDNA的序列比較以及所構(gòu)成的系統(tǒng)樹也表明, 鄱陽湖的氣絲藻與A. funiforme Lao26和A. funiforme Lao35聚為一簇(圖2)?？傊? 通過形態(tài)學(xué)特征、藻膽蛋白的光譜特征和16S rDNA的序列表明, 鄱陽湖分離到的藻種確定為中國新記錄屬氣絲藻屬Aerosakkonema的模式種索狀氣絲藻Aerosakkonema funiforme。

已知?dú)饨z藻屬 Aerosakkonema藻種主要分布在亞洲, 可以形成水華[6], 目前Aerosakkonema藻株中尚未監(jiān)測出微囊藻毒素, Anatoxin-a和PSP等藍(lán)藻毒素, 因而索狀氣絲藻的毒性還未能確定。根據(jù)野外調(diào)查結(jié)果, 鄱陽湖水體中索狀氣絲藻在全湖的敞水區(qū)域都有分布, 但并未見其水華現(xiàn)象。但由于索狀氣絲藻的氣囊結(jié)構(gòu)使其為潛在的水華藍(lán)藻種類, 隨著環(huán)境變化及水體富營養(yǎng)化的進(jìn)程, 索狀氣絲藻有可能成為我國的藍(lán)藻水華種類的新類群, 因此今后開展對氣絲藻屬和模式種索狀氣絲藻生物學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)研究, 將對深入研究我國淡水生態(tài)系統(tǒng)中水華藍(lán)藻多樣性以及藻類演替和水華發(fā)生具有重要意義。

[1] Carmichael W W. Health effects of toxin producing cyanobacteria: “the CyanoHABs” [J]. Human and Ecological Risk Assessment 1, 2001, 7(5): 1393—1407

[2] Wu Z X, Yu B S, Peng X, et al. Planktothricoides, a newly recorded genus of water bloom forming cyanophyta in China [J]. Journal of Wuhan Botanical Research, 2008, 26(5): 461—465 [吳忠興, 余博識, 彭欣, 等. 中國水華藍(lán)藻的新記錄屬—擬浮絲藻(Planktothricocides). 武漢植物學(xué)研究, 2008, 26(5): 461—465]

[3] Yu B S, Wu Z X, Zhu M L, et al. The formation of cyanobacterial bloom in the Shuiguohu Bay and its effect onDonghu Lake, Wuhan [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(2): 286—289 [余博識, 吳忠興, 朱夢靈, 等. 水果湖灣藍(lán)藻水華的形成及其對東湖影響的評價. 水生生物學(xué)報, 2008, 32(2): 286—289]

[4] Anagnostidis K, Komarek J. Modern approach to the classification system of cyanophytes 3-Oscillatoriales [J]. Algological Studies/Archiv für Hydrobiologie, 1988, (50—53): 327—472

[5] Suda S, Watanabe M M, Otsuka S, et al. Taxonomic revision of water-bloom-forming species of oscillatorioid cyanobacteria [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 52(Pt5): 1577—1595

[6] Nanda K T, Yuuhiko T, Masaki Y, et al. Aerosakkonema funiforme gen. et sp. nov. (Oscillatoriales), a new gas-vacuolated oscillatorioid cyanobacterium isolated from a mesotrophic reservoir [J]. Phycologia, 2012, 51(6): 672—683

[7] Rippka R. Recognition and identifcation of cyanobacteria [J]. Methods in Enzymology, 1988, 167: 28—67

[8] Kasai F, Kawachi M, Erata M, et al. NIES-Collection list of strains (8th edition) [J]. The Japanese Journal of Phycology (S?rui), 2009, 57(1): 216

[9] Wang J, Xie S L, Wang Z J, et al. Molecular diversity and microcystin production of Microcystis in Fenhe River of Taiyuan [J]. Journal of Lake Sciences, 2011, 23(4): 505—512 [王捷, 謝樹蓮, 王中杰, 等. 汾河(太原市景區(qū)段)微囊藻的分子多樣性及產(chǎn)毒能力. 湖泊科學(xué), 2011, 23(4): 505—512]

[10] Lin S, Wu Z, Yu G, et al. Genetic diversity and molecular phylogeny of Planktothrix (Oscillatoriales, cyanobacteria) strains from China [J]. Harmful Algae, 2010, 9(1): 87—97

[11] Turner S, Pryer K M, Miao V P, et al. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis [J]. Journal of Eukaryot Microbiology, 1999, 46(4): 327—338

[12] Devereux R, He S, Orkland S, et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family [J]. Journal of Bacteriology, 1990, 172(7), 3609—3619

[13] Shoichiro S, Liu Y D, He J W, et al. Morphological, biochemical and physiological characteristics of Lyngbya hieronymusii var. hieronymusii (Oscillatoriales, Cyanobacteria) [J]. Phycological Research, 1998, 46(2): 51—55

[14] Wen S H, Xu C Y, Ju B, et al. Purification and properties of phycobiliprotein in Porphyridium cruentum [J]. Marine Science Bulletin, 2000, 19(3): 90—94 [溫少紅, 徐春野,鞠寶, 等. 紫球藻藻紅蛋白的分離純化及光譜特性研究. 海洋通報, 2000, 19(3): 90—94]

AEROSAKKONEMA, A NEWLY REPORTED GENUS OF WATER BLOOM FORMING CYANOBACTERIA IN THE POYANG LAKE OF CHINA

LI Shou-Chun1, HUANG Jing1,2, YU Gong-Liang2and LI Ren-Hui2
(1. School of Sciences in Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430027, China)

During a recent field survey of the water bloom forming cyanobacteria in the Poyang Lake, we collected a type of gas-vacuolated filamentous cyanobacterial. Six strains of this species were isolated and purified after the culture in the lab. The 16S rRNA gene sequence of this species showed a high similarity (98%) with those of two strains from the Nam Ngum Reservoir of Lao People’s Democratic Republic. This result, together with their morphological characteristics, suggested that these six strains were different from other Oscilatorialean cyanobacteria. Therefore this species was identified as Aerosakkonema funiforme that belonged to Aerosakkonema (Nanda & Watanabe 2012). Aerosakkonema is a new record of cyanobacteria genus in China.

Aerosakkonema; Aerosakkonema funiforme; Filamentous cyanobacteria; Water bloom; Poyang Lake

Q949.22

A

1000-3207(2014)06-1071-05

10.7541/2014.157

2013-11-11;

2014-03-07

國家科技重大專項(2012ZX07101-002-001); 鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實驗室(江西師范大學(xué))開放基金(PK2014007); 江西省自然科學(xué)基金(20132BAB204006)資助

李守淳(1965—), 女, 江西余干人; 博士; 主要從事藻類生物學(xué)研究。E-mail: lsc_982@126.com

李仁輝(1965—), 研究員; 主要從事藍(lán)藻分類系統(tǒng)以及藻類環(huán)境生物學(xué)研究。E-mail: reli@ihb.ac.cn