郭巖，孔佑華，王鳳琴

(1.濟寧醫(yī)學院組胚教研室;山東 濟寧 272067;2.形態(tài)學實驗室)

眼由眼球壁和玻璃體等內容物構成，各部分組織類型及硬度差異顯著，這一特點導致眼組織切片制作有一定困難。視網膜分布于玻璃體周圍及后方的眼球內壁，其視部為高度特化的神經組織，獨立而規(guī)則的視網膜標本不易得到。因此，本研究將取材的眼球標本給予2 種不同處理，以得到組織形態(tài)和細胞排列相對規(guī)則的杯狀視網膜，通過不同厚度切片比較，最終得到適合免疫熒光染色的優(yōu)質切片，現(xiàn)將具體實驗方法及體會描述如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗用SD 大鼠30 只，體重約(200 ±20)g，雌雄不限，正常喂食和飲水，12 h明暗交替光照。由濟寧醫(yī)學院實驗動物房提供。

1.1.2 主要試劑 生理鹽水、蔗糖、水合氯醛(上海醫(yī)藥集團);4% 多聚甲醛 (PFA)、0.1%PBS、OCT 包埋劑(Sigma 公司);CD31 和GS 抗體(Abcam 公司)。

1.1.3 主要儀器 CM1900 冰凍切片機(Leica 公司);體視顯微鏡(SMZ168，Motic);IX71 熒光顯微鏡、IX7 倒置熒光顯微鏡、DP70 顯微數(shù)碼攝像機(Olympus 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 固定前眼球標本的2 種不同處理方式(1)灌注取眼球方法:取SD 大鼠稱重，10%水合氯醛以0.4 ml/100 g 腹腔注射麻醉。迅速打開胸腔充分暴露心臟，套管針刺入左心室并進針到升主動脈，取出內芯，連接生理鹽水快速灌注，同時剪開右心耳。當其流出液體變?yōu)榈凵翢o色后更換為4%多聚甲醛灌注。摘除大鼠眼球，部分置于改良眼球專用固定液Kolmer 液(5%重鉻酸鉀4 份，10%甲醛4 份，冰醋酸1 份、三氯醋酸1份、10%醋酸鈉1 份)［1］;部分以4%多聚甲醛固定。(2)不灌注直接取眼球方法:SD 大鼠稱重后10%水合氯醛以0.4 ml/100 g 腹腔注射麻醉。直接摘除大鼠眼球，部分置于改良眼球專用固定液Kolmer 液，部分置于4%多聚甲醛固定液。

1.2.2 固定 根據(jù)固定前眼球標本的2 種不同處理方式，采取不同的固定時間。(1)在體視顯微鏡下，于角鞏膜緣水平剪開眼球，吸除晶狀體、玻璃體，于4%多聚甲醛中固定2 h。(2)角膜剪小口，4%多聚甲醛中固定6 h。將固定后的標本投入10%蔗糖進行脫水處理。待標本于10%蔗糖溶液中下沉至容器底部后，換至30%蔗糖溶液，4℃過夜。

1.2.3 包埋與冷凍 脫水后標本以視神經根部為標志，水平或垂直方向放置，以便得到視網膜橫切面和縱切面，分別放入小橡皮塞或適當容器，OCT 膠充分包埋，若眼球處理時已去除玻璃體，為避免氣泡產生可將OCT 膠滴入視杯中［1］。編寫樣本序號，液氮速凍，放置－80 ℃冰箱貯藏，待2 周后標本集齊分批次處理。

1.2.4 切片與貼片 針對視網膜組織屬性將冷凍箱溫度調節(jié)至－20 ℃，標本頭溫度依次調節(jié)至－15 ℃與－20 ℃。待實際溫度降至相應數(shù)值時，快速從－80 ℃取出標本塊，以雙蒸水將其固定于冷凍架上的標本托，按序號順序置于標本盤中。將標本固定于標本頭，按下位于機箱左上方的粗進料按鈕，依次調節(jié)厚度為6、8、10、12 及14 μm，轉動手柄將標本移向刀片，邊觀察邊將組織塊修整至恰當平面。適當調節(jié)防卷板位置，一般情況比刀刃稍微超出約1.5 mm 為宜，也可視情況而定。

待觀察到較大“C”字形視網膜結構時開始貼片收集至黏附性載玻片。收集貼片時采用常溫載玻片。切片后將防傾板打開的同時迅速以載玻片靠近吸附，通常即會得到緊密貼附舒展的視網膜組織，若未能緊貼，需將載玻片放置在冰凍切片機玻璃箱蓋片刻即可。將收集到的切片整齊同向排列于載玻片，以3～4 樣本/片為宜。

1.2.5 免疫熒光染色 按照免疫熒光染色步驟進行操作，于熒光顯微鏡下觀察比較不同取材方法和不同厚度冰凍切片的熒光染色效果。

2 結果

組織形態(tài)觀察:(1)取材時采用去除玻璃體處理的視網膜組織形態(tài)弧度不甚圓滑，但大部分細胞層次規(guī)律。免疫標記清晰，熒光抗體激發(fā)狀態(tài)良好，以10 μm 和12 μm 厚度的樣本為最佳。(2)取材時采用保留玻璃體者，大多數(shù)視網膜圓滑無皺褶，各層細胞排列規(guī)律，結構清晰，保持了視網膜基本形態(tài)，偶爾見組織牽拉。與保留視杯標本相比，同樣厚度切片免疫熒光激發(fā)明顯減弱，也是以10 μm 和12 μm 厚度的樣本為最佳。

3 討論

有學者不建議對動物進行灌注固定，認為以4%多聚甲醛灌注大鼠心臟時，滲透到視網膜各層的多聚甲醛，因局部組織液和血液的缺失而濃度過高，使該部分組織發(fā)生強烈收縮而導致結構改變，失去其原貌［2］。另外，由于視網膜不同層次之間毛細血管密度不同，使得不同濃度的多聚甲醛產生不同收縮力，導致組織細胞聚集、層次分離和著色不均等后果，不利于后期免疫熒光標記研究。本研究分別對灌注固定取材和未灌注直接取材的視網膜進行同樣厚度的冰凍切片和血管內皮免疫熒光標記，鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯毛細血管差異變化。因此，灌注固定或許會影響視網膜色素上皮層及其他神經細胞層，但針對視網膜血管研究并未造成顯著影響。李慧等［3］認為切片放置時間不宜超過30 d，否則冰凍切片的抗原性質會發(fā)生改變，影響實驗的科學性和準確性。本研究在2 周內進行免疫熒光標記。據(jù)王秀萍［4］報道，細胞排列致密且較硬的組織，冰凍切片的溫度應控制在－16～－20 ℃;細胞排列疏松且較軟的組織，冰凍切片的溫度控制在－20～－22 ℃;脂肪組織冰凍切片的溫度控制在－22～－24 ℃可以獲得良好的切片效果。本研究標本頭溫度依次調節(jié)至－15 ℃與－20 ℃。

視網膜存在于眼球壁最內層，將眼球于角鞏膜緣延赤道線剪開，吸除晶狀體和玻璃體等內容物，即暴露視網膜，便于從固定液滲透、蔗糖脫水到抗體孵育不需要消耗較長時間就能達到良好的效果。實驗中發(fā)現(xiàn)某些視網膜組織產生冰晶，令局部結構發(fā)生改變，影響標記位置和實驗結果。把握好組織固定脫水的時間，或在脫水后立即進行液氮速凍是減少和消除冰晶的有效措施。有研究認為用液體沖洗后及時用濾紙吸干可減少冰晶產生［5］。包埋劑可采用進口OCT包埋劑或普通合成膠水，冷凍效果并無明顯差異［6－7］。因此對于樣本量較大的實驗或臨床病理科可以考慮以普通合成膠水代替OCT 包埋劑，從而節(jié)約實驗或病理診斷成本。冰凍切片的目的是保持組織固有結構形態(tài)的同時還應盡量避免降低抗原性，以便成功標記，得到滿意的實驗結果，若采用石蠟切片，在做免疫熒光標記之前應先做抗原修復。

用于免疫熒光的組織標本應盡量保持其完整的固有形態(tài)，通過對目標結構的定性、定位以及定量，再現(xiàn)視網膜各成分的狀態(tài)。實驗者可根據(jù)需要選擇最適合的眼組織取材方法、切片厚度等以便得到滿意的最終效果。

［1］李晶晶，朱鴻，施彩虹.三種方法對大鼠視網膜固定效果的比較研究［J］.上海交通大學學報 (醫(yī)學版)，2011，31(8):1105－1107.

［2］曾玉曉，陳中山，田春雨，等.動物眼視網膜冰凍切片制作方法［J］.眼科新進展，2007，27 (11):831－832.

［3］李慧，黃景陽，袁中瑞.提高腦組織冰凍切片質量的幾點體會［J］.中國免疫學雜志，2012，28 (11):1019－1022

［4］王秀萍.冰凍切片制作中時間和溫度的控制［J］.醫(yī)學綜述，2013，19 (22):4213－4214.

［5］邴魯軍，高英茂，郭雨霽，等.冷凍切片常遇到的問題及解決對策.［J］.醫(yī)學信息，2006，19 (9):1631－1633.

［6］許平，王筱璨，陳奎生.快速冰凍切片制備方法的改進［J］.鄭州大學學報(醫(yī)學版)，2010，45 (2):241－243.

［7］黃小麗，張培誼，唐新萍，等.用普通膠水代替進口冰凍包埋劑進行冰凍切片的探討［J］.中國醫(yī)藥導刊，2013，15:185.