宋志紅, 孟慶忠, 張 濤, 張勝昔, 王貴春, 李國榮

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中游棉花生物學(xué)與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(武漢), 武漢 430064

ISSR(inter-simple sequence repeat)是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記，即簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記[1,2]。該技術(shù)具有引物設(shè)計(jì)容易、操作簡(jiǎn)單、成本低、可重復(fù)性高和不使用同位素等特點(diǎn)。目前，應(yīng)用該技術(shù)在水稻[3]、小麥[4]和玉米[5]等作物上開展了品種鑒定、遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構(gòu)建等工作。本文簡(jiǎn)要介紹ISSR標(biāo)記技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其在棉花遺傳育種中的應(yīng)用，并對(duì)ISSR標(biāo)記技術(shù)在棉花研究中存在的問題和應(yīng)用前景進(jìn)行了探討。

1 ISSR分子標(biāo)記

1.1ISSR分子標(biāo)記的原理

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)或短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STR)，指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(1～4個(gè))為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列[1]。它們?cè)谥参锘蚪M中大量分布。簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記 (inter simple sequence repeat，ISSR)的基本原理是在SSR的3′或5′端錨定1～4個(gè)堿基作引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，錨定引物可以引起特定位點(diǎn)退火，引發(fā)與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片斷的擴(kuò)增，所擴(kuò)增的條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以此結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析[6]。

1.2ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)無需基因文庫構(gòu)建、雜交和同位素顯示等步驟，操作更加簡(jiǎn)單、快速和高效；遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性較高；另外，結(jié)合RAPD和SSR技術(shù)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，樣品需求量少，模板DNA用量少。不足之處在于需要確定最佳反應(yīng)條件；且呈顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型；ISSR引物可能在特定基因組DNA中沒有配對(duì)區(qū)域，而導(dǎo)致無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)[7]。

2 ISSR技術(shù)在棉花遺傳育種中的應(yīng)用

ISSR分子標(biāo)記是植物進(jìn)行種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及標(biāo)記輔助選擇育種等方面研究的有效手段[8]，ISSR分子標(biāo)記在棉花中的研究，對(duì)其遺傳育種起到了重要的指導(dǎo)作用，為棉花分子育種積累了一定的理論基礎(chǔ)。

2.1遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

農(nóng)業(yè)起源和發(fā)展的基本前提是擁有種質(zhì)資源，改良品種、選育新品種及遺傳生物學(xué)研究都需要以遺傳變異和基因資源豐富的種質(zhì)資源為基礎(chǔ)。遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析是植物種質(zhì)資源研究和評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容之一。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠檢測(cè)出品種間微小的差異，因此，被廣泛應(yīng)用于植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究[9]。

國內(nèi)學(xué)者利用ISSR分子標(biāo)記主要對(duì)國內(nèi)外不同地區(qū)棉花的種質(zhì)資源進(jìn)行了分析。蘇亞蕊等[10]利用ISSR分子標(biāo)記分析了開封市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的48份陸地棉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性。引物平均多樣性信息指數(shù)(polymorphism information content，PIC)和多態(tài)性譜帶百分率(percentage of polymorphic bands，PPB)分別為0.76％和87.88％。ISSR標(biāo)記揭示出這48份棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性較低，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。劉新浩等[11]利用6個(gè)ISSR引物對(duì)23個(gè)棉花資源品系進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，聚類分析表明，在遺傳距離GD值0.63水平上將23個(gè)棉花品種可聚成兩大類。品種間遺傳距離GD變幅為0.13 253～0.67 717。結(jié)果顯示出這23個(gè)棉花品種遺傳變異較大，遺傳基礎(chǔ)寬闊。武耀廷等[12]利用RAPD、SSR和ISSR 3種分子標(biāo)記方法和兩年田間實(shí)驗(yàn)將國內(nèi)外36個(gè)陸地棉栽培品種大致分為國外品種、新疆品種、早熟類型品種和我國的中熟棉品種等幾個(gè)類群。姜偉等[13]采取ISSR分子標(biāo)記對(duì)48份棉花種質(zhì)資源(河南、河北、山東、新疆、廣東和美國等)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，多態(tài)率達(dá)83.70％。將48個(gè)種質(zhì)資源劃分為4個(gè)大類(GS=0.55)。以上研究表明，ISSR具有豐富遺傳多樣性和穩(wěn)定性，是一種較好的遺傳分子標(biāo)記，適宜于棉花品種遺傳多樣性分析。

國外學(xué)者利用ISSR分子標(biāo)記研究棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析主要包括不同棉花基因型分析、雜交后代(F1、F2)分析、抗病抗蟲資源分析及不同分子標(biāo)記系統(tǒng)的對(duì)比等。Bardak等[14]利用39個(gè)SSR和5個(gè)ISSR標(biāo)記引物來標(biāo)記25個(gè)基因型棉花品種(二倍體和四倍體基因型棉花)。遺傳多樣性值的范圍為0.04～0.58。分析證明商業(yè)品種的遺傳多樣性比較低，應(yīng)引入野生型棉花種質(zhì)資源庫來增加遺傳多樣性。Sharaf等[15]用RAPD、ISSR和AFLP 3種標(biāo)記研究了7個(gè)棉花基因型(包括3個(gè)埃及棉品種、3個(gè)敘利亞的陸地棉品種和1個(gè)美國三角洲松棉品種)間的遺傳變異和親緣關(guān)系，3種RAPD、ISSR和AFLP引物標(biāo)記檢測(cè)的多態(tài)性分別為71.81％、88.57％和50.52％?；?種標(biāo)記及組合的數(shù)據(jù)將7個(gè)棉花品種分為兩個(gè)主要的集群(陸地棉的4個(gè)基因型棉花和海島棉3個(gè)基因型棉花)。Noormohammadi等[16]用30個(gè)RAPD引物和8個(gè)ISSR引物研究了棉花bellizovar和tabladilla的雜交后代F1和F2的遺傳多樣性。30個(gè)RAPD引物共檢測(cè)到191條帶，其中63條為多態(tài)帶。8個(gè)ISSR引物檢測(cè)到86條帶，其中27條為多態(tài)、59條為單態(tài)。一些條帶在F1后代出現(xiàn)而在同一基因型的F2后代缺失。聚類分析將Siokra×belilzovar的F1和F2代分為一組。Noormohammadi等[17]用10個(gè)ISSR引物研究了陸地棉棉花品種Mehr及其雜交后代的分子遺傳多樣性。其多態(tài)性為54.35％。ubc834引物顯示最高有效等位基因數(shù)、多樣性指數(shù)和遺傳多樣性。另外有一些ISSR帶只出現(xiàn)在親本基因型中，而另一些ISSR帶僅出現(xiàn)在雜交基因型中。Noormohammadi等[18]用30個(gè)RAPD引物和10個(gè)ISSR引物來評(píng)估四倍體雜交棉F2群體基因型的遺傳多樣性(陸地棉)。30個(gè)RAPD引物多態(tài)性為66.44％，10個(gè)ISSR引物多態(tài)性為67.82％。基于ISSR數(shù)據(jù)分析，雜交品種Mehr×tabladila和tabladila×Siokra表現(xiàn)出最低的遺傳相似系數(shù)0.59，而雜交品種No.200X×belilzovar和tabladila×sindose表現(xiàn)出最高的遺傳相似系數(shù)。研究表明，利用RAPD和ISSR數(shù)據(jù)可提供雜交基因型高分辨率的分子分布。Donger等[19]利用40個(gè)RAPD和19個(gè)ISSR引物探討了24個(gè)陸地棉種質(zhì)資源(12個(gè)抗白葉枯病、12個(gè)抗葉蟬和棉鈴蟲)的遺傳多樣性。RAPD和ISSR標(biāo)記的聚類相似系數(shù)分別為0.55～0.94和0.39～0.98。RAPD和ISSR多態(tài)性的平均值分別為68.68％和76.55％，說明ISSR標(biāo)記比RAPD可提供更多的信息。Adawy等[20]利用AFLP、ISSR、RAPD和SSR先后分析了兩個(gè)棉花基因型之間的遺傳多態(tài)性，探討不同標(biāo)記系統(tǒng)的效率，結(jié)果表明，不同的標(biāo)記系統(tǒng)檢測(cè)多態(tài)性的機(jī)制、基因組的覆蓋范圍和應(yīng)用的難易程度不同。因此，這些分子標(biāo)記可以相互補(bǔ)充，得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。

2.2種質(zhì)鑒定

DNA指紋圖譜(DNA fingerprinting)技術(shù)是目前種質(zhì)資源收集和種質(zhì)鑒定中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)，可對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)估，以及對(duì)品種真實(shí)性和純度進(jìn)行鑒定。目前品種鑒定主要是通過分子標(biāo)記技術(shù)獲得品種的指紋圖譜，而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)由于其穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)在種質(zhì)鑒定中將會(huì)越來越重要[8]。

國內(nèi)外運(yùn)用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行棉花品種鑒定的研究還很少。姜偉等[21]從60條ISSR條引物中篩選到11條擴(kuò)增效果好的引物，用其中2條引物UBC809和UBC841首次建立了8個(gè)品種的指紋圖譜，可將8個(gè)棉花品種互相區(qū)別。

2.3遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及標(biāo)記輔助選擇育種

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)因具有較高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和高度多態(tài)性，且分布在整個(gè)染色體上，被廣泛應(yīng)用于繪制遺傳連鎖圖譜和基因定位[22]。袁有祿[23]用221對(duì)SSR引物、1 840個(gè)RAPD引物和77個(gè)ISSR引物對(duì)棉花親本纖維強(qiáng)度、麥克隆值(micronaire)和長(zhǎng)度極值庫篩選后得到了15個(gè)標(biāo)記，其中12個(gè)標(biāo)記分成了3個(gè)連鎖群，并檢測(cè)到一個(gè)高強(qiáng)纖維的主效QTLs。Abdi等[24]研究了28個(gè)棉花品種(包括8個(gè)伊朗棉花品種)的耐鹽性(NaCl)。用14個(gè)ISSR引物產(chǎn)生65個(gè)多態(tài)性DNA片段。根據(jù)ISSR標(biāo)記將28個(gè)棉花品種分為三群(耐鹽害品種、鹽害敏感品種和中間品種)，并且找到與鹽害(NaCl)處理相關(guān)的3個(gè)分子標(biāo)記。這些標(biāo)記可能幫助育種者進(jìn)行輔助選擇育種，以提高棉花品種對(duì)鹽脅迫的耐受性。

3 問題與展望

ISSR分子標(biāo)記已在棉花遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和標(biāo)記輔助育種等方面取得了較大進(jìn)展，但與其他作物相比，還存在諸多問題和不足。ISSR 分子標(biāo)記在棉花上的研究多局限在棉花遺傳多樣性研究及親緣關(guān)系分析上，并且國內(nèi)研究落后于國外研究。國內(nèi)學(xué)者僅對(duì)國內(nèi)外不同地區(qū)棉花的種質(zhì)資源進(jìn)行了分析，國外學(xué)者則在不同棉花基因型分析、雜交后代(F1、F2)分析、抗病抗蟲資源分析及不同分子標(biāo)記系統(tǒng)的對(duì)比等方面都有研究，因此，國內(nèi)學(xué)者未來可開展相應(yīng)的研究，拓寬ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在棉花遺傳多樣性研究及親緣關(guān)系分析上的應(yīng)用。在種質(zhì)鑒定方面，利用ISSR分子標(biāo)記已經(jīng)在其他作物的種質(zhì)鑒定中有成功應(yīng)用，例如，Charters和Wilkinson[25]運(yùn)用ISSR技術(shù)，僅用6條引物就能將62個(gè)可可種質(zhì)資源的樣品中的56個(gè)區(qū)分開； Kumar等[26]成功運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了4個(gè)有爭(zhēng)議的辣椒(Capsicumannum)品種，是運(yùn)用DNA分子標(biāo)記方法來維護(hù)育種者權(quán)利的首次嘗試。因此，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)必將在棉花種質(zhì)資源評(píng)估及品種真實(shí)性和純度鑒定中發(fā)揮重要作用。在遺傳圖譜構(gòu)建方面，迄今，國內(nèi)外已發(fā)表的棉花種間分子遺傳圖譜的分子標(biāo)記有RFLP、AFLP、SSR、EST-SSR、REMAP和SRAP等標(biāo)記[27]，而利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)棉花進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位的研究還較少。近十年來，利用分子標(biāo)記對(duì)棉花遺傳圖譜的研究工作已經(jīng)深入展開，但現(xiàn)有棉花遺傳連鎖圖還存在圖譜所用的標(biāo)記數(shù)較少、基因組覆蓋率不高且分布不均勻、存在標(biāo)記間距離過大或有些染色體上沒有標(biāo)記等問題[27]。ISSR標(biāo)記由于遍布整個(gè)基因組且高度多態(tài)性的特點(diǎn)，能夠成為繪制遺傳連鎖圖的理想標(biāo)記。但I(xiàn)SSR由于顯性標(biāo)記的特點(diǎn)，應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建存在不足，在研究中結(jié)合其他共顯性的分子標(biāo)記如SSR或SCAR，才能更好地解決遺傳作圖、基因定位等工作中的問題。例如，Doucleff等[28]利用了32個(gè)RAPD、9個(gè)SSR和24個(gè)ISSR引物的3種分子標(biāo)記方法構(gòu)建了葡萄的遺傳連鎖圖。因此，今后棉花遺傳圖譜研究中，可利用ISSR標(biāo)記和其它分子標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合來共同構(gòu)建，以豐富棉花遺傳圖譜。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展使其成為棉花分子遺傳及輔助育種研究的重要工具[29]。在棉花遺傳育種中，如何發(fā)揮ISSR分子標(biāo)記在植物遺傳和輔助育種研究應(yīng)用中的諸多優(yōu)點(diǎn)[30]，有待進(jìn)一步的加強(qiáng)研究以推動(dòng)棉花遺傳育種進(jìn)程。

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