史利寧，胡毓安，廖紅，韓雪，韓丹丹，李曉軍，李芳秋

0 引言

在惡性血液病、造血干細(xì)胞移植及器官移植患者中，由于存在免疫功能缺陷，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是感染死亡的主要原因之一［1］。長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物和粒細(xì)胞缺乏癥是IA最主要的危險(xiǎn)因素［2］?，F(xiàn)有的抗真菌藥物對(duì)IA的療效有限，且有較強(qiáng)的毒副作用;因此亟需開(kāi)辟新的治療途徑，而以曲霉疫苗為基礎(chǔ)的預(yù)防接種法開(kāi)始受到越來(lái)越多的重視［3］。

早期研究表明曲霉疫苗可在免疫抑制宿主中誘導(dǎo)出保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而降低宿主的死亡率。雖然曲霉疫苗保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚，但已證明T細(xì)胞免疫尤其是CD4+Th1型細(xì)胞免疫在控制曲霉感染中發(fā)揮了極其重要的作用［4］。因此，目前曲霉疫苗的研究主要是尋找可增強(qiáng)或激活Th1細(xì)胞免疫的曲霉保護(hù)性抗原。但到目前為止，已篩選鑒定的曲霉保護(hù)性抗原極少，且無(wú)成熟有效的曲霉疫苗可用于臨床。

本課題組在前期研究中篩選鑒定了一個(gè)新的強(qiáng)免疫反應(yīng)性煙曲霉硫氧還蛋白還原酶GliT抗原(thioredoxin reductase GliT，TR)［5］。為評(píng)估煙曲霉TR蛋白是否具有保護(hù)性抗原的潛能，建立并優(yōu)化了檢測(cè)TR/抗原特異性T淋巴細(xì)胞(TR/AST)分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)的ELISPOT方法，分析健康人在TR的刺激下產(chǎn)生免疫應(yīng)答的類(lèi)型，探討TR抗原特異性T淋巴細(xì)胞在IA中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取我院門(mén)診20名健康體檢者，男性12名，女性8名，年齡25～35歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批件號(hào):2013GJJ-063)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器TR抗原由中心實(shí)驗(yàn)科分子生物實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)自制提?。?］，IFN-γ及IL-4 ELISPOT檢測(cè)試劑盒、EZ-Culture無(wú)血清培養(yǎng)基，Biosys Bioreader 4000 PRO斑點(diǎn)分析儀及分析軟件均為深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離采空腹靜脈血5～10 mL，無(wú)菌肝素抗凝，加等量等滲鹽水稀釋后加在淋巴細(xì)胞分離液上，800×g離心30 min，分離PBMC，用EZCulture液洗滌800×g 10 min離心2次，以EZ-Culture無(wú)血清培養(yǎng)液重懸并行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 確定ELISPOT試驗(yàn)條件隨機(jī)選擇2名健康人進(jìn)行試驗(yàn)，用方陣滴定法優(yōu)化ELISPOT反應(yīng)條件。設(shè)定TR抗原終濃度為45，30，20，10，5μg/孔五個(gè)濃度，PBMC用量為1×106，3×105，1×105，3×104個(gè)/孔四個(gè)濃度。根據(jù)系列抗原濃度及PBMC用量獲得的IFN-γ陽(yáng)性斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot forming cell，SFC)頻數(shù)結(jié)果，確定TR抗原的工作濃度及PBMC的用量。

1.3.3 特異性分泌IFN-γ SFC及IL-4 SFC的ELISPOT檢測(cè)無(wú)菌條件下使用ELISPOT板及相關(guān)試劑，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:每孔加入200μL EZ-Culture無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫靜置5～10 min后傾去。每孔加入100 μL 3×105PBMC，以10 μL TR抗原(10 μg/孔)作為特異性抗原刺激物，每份檢測(cè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔、2個(gè)陰性對(duì)照孔、2個(gè)試劑對(duì)照孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞濃度為每孔1×105細(xì)胞，試劑對(duì)照孔加EZ-Culture無(wú)血清培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照孔的刺激物為PHA/PMA，陰性對(duì)照孔的刺激物為無(wú)血清培養(yǎng)基。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h?？焖賰A倒孔內(nèi)細(xì)胞后，每孔加200μL 4℃預(yù)冷的去離子水，冰浴10 min低滲裂解細(xì)胞。傾去液體，每孔加250 μL磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌7次后在干凈紗布上拍干。每孔加100 μL相應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，于37℃孵育1h。PBST洗滌5次后，揭開(kāi)板底的塑料保護(hù)層，用PBST沖洗。每孔加100 μL工作濃度酶標(biāo)鏈霉親和素，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，最后每孔加100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，于室溫條件下避光靜置25 min顯色。用自來(lái)水洗滌3次以終止顯色反應(yīng)。將板放置在室溫陰涼處晾干。用Biosys Bioreader 4000 PRO斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)特異性分泌細(xì)胞因子的陽(yáng)性SFC頻數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組檢出的特異性分泌IFN-γ SFC和IL-4 SFC為非正態(tài)分布，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);TR與其他曲霉保護(hù)性抗原特異性T淋巴細(xì)胞的比較用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISPOT試驗(yàn)條件的確定健康人PBMC對(duì)不同量TR抗原刺激所產(chǎn)生的IFN-γ SFC頻數(shù)無(wú)明顯差異;在相同量TR抗原刺激下，產(chǎn)生的IFN-γ SFC頻數(shù)隨PBMC用量的減少而減少。根據(jù)方陣滴定法確定TR抗原的終濃度為10 μg/孔，PBMC用量為3×105/孔。在此條件下特異性分泌IFN-γ SFC頻數(shù)最優(yōu)，2名健康人的陽(yáng)性SFC頻數(shù)分別為53個(gè)和143個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同抗原濃度及PBMC用量獲得的IFN-γ SFC頻數(shù)結(jié)果Figure 1 Frequencies of IFN-γ spot－forming cells induced with different TR antigen concentrations and peripheral blood mononuclear cells(PBMC)

2.2 ELISPOT檢測(cè)T淋巴細(xì)胞特異性分泌IFN-γ SFC與IL-4 SFC的結(jié)果TR刺激后，健康人特異性分泌IFN-γ和IL-4的SFC頻數(shù)分別為15(3.5，59.5)個(gè)和0(0，0)個(gè)。IFN-γ的SFC頻數(shù)顯著高于IL-4(P＜0.001)，其中刺激后產(chǎn)生強(qiáng)IFN-γ應(yīng)答(SFC≥20個(gè))的健康人占45%(9/20)，而19名健康人在TR刺激后不產(chǎn)生IL-4應(yīng)答，僅1名產(chǎn)生IL-4應(yīng)答。見(jiàn)圖2。

圖2 20名健康人特異性分泌IFN-γ和IL-4的SFC頻數(shù)比較Figure 2 Frequencies of IFN-γ and IL-4 spot－formingcells(SFC)in the 20 healthy individuals

2.3 與文獻(xiàn)報(bào)道的曲霉保護(hù)性抗原的比較與文獻(xiàn)報(bào)道的曲霉保護(hù)性抗原Asp f3和Asp f9/16相比［4，7－8］，TR抗原刺激健康人PBMC所產(chǎn)生的強(qiáng)IFN-γ應(yīng)答無(wú)顯著差異，但I(xiàn)L-4應(yīng)答明顯低于Asp f3(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

表1 TR與其他曲霉保護(hù)性抗原在誘導(dǎo)IFN-γ和IL-4免疫應(yīng)答中的比較(n)Table 1 Comparison of TR and other Aspergillus protective antigens in inducing IFN-γ and IL-4 immune responses(n)

3 討論

IA的有效治療仍是目前臨床亟待解決的重要問(wèn)題，而預(yù)防接種正成為IA治療的新手段，尋找高效的曲霉保護(hù)性抗原則是預(yù)防接種能否成功的關(guān)鍵。動(dòng)物試驗(yàn)表明在小鼠IA動(dòng)物模型中Th1/Th2比例的失調(diào)及向Th2型免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了IA的惡化及不良結(jié)局［9］。臨床試驗(yàn)觀察在健康人群和發(fā)生IA后存活的患者中均發(fā)現(xiàn)了顯著的產(chǎn)生IFN-γ抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖［9］，證實(shí)了Th1型免疫反應(yīng)在控制曲霉感染中發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用［10］。

當(dāng)T細(xì)胞受到某種抗原刺激時(shí)，針對(duì)該抗原的特異性T淋巴細(xì)胞就會(huì)活化，產(chǎn)生特定的細(xì)胞因子。ELISPOT技術(shù)可通過(guò)檢測(cè)其分泌特定細(xì)胞因子的SFC頻數(shù)來(lái)直觀地反映T細(xì)胞的免疫反應(yīng)類(lèi)型。本研究以煙曲霉TR為刺激物，觀察其刺激正常人外周血淋巴細(xì)胞后的免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示:TR刺激后可產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞的活化，主要表現(xiàn)為IFN-γ SFC頻數(shù)的明顯增加，而IL-4 SFC頻數(shù)幾乎為零，且45%的健康人表現(xiàn)為強(qiáng)IFN-γ應(yīng)答。由此可見(jiàn)，健康人體內(nèi)普遍存在TR特異性T細(xì)胞族群，可經(jīng)TR刺激后呈Th1優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，該免疫反應(yīng)可以提高機(jī)體對(duì)未來(lái)曲霉感染的防御能力，表明TR具有作為保護(hù)性抗原的潛能。由于不同的人對(duì)TR刺激后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度不一且差異較大，因此還需尋找其他方法，比如使用佐劑等來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)TR抗原刺激的免疫效應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。

文獻(xiàn)報(bào)道的煙曲霉保護(hù)性抗原有Asp f3和Asp f9/16等，其中最早檢測(cè)的是曲霉變應(yīng)原Asp f9/16［7，11－13］。Bozza等［9］發(fā)現(xiàn)，在中性粒細(xì)胞缺乏癥小鼠模型中，鼻內(nèi)接種重組Asp f9/16和佐劑CpG ODN可誘導(dǎo)抗煙曲霉感染的保護(hù)性應(yīng)答。有研究證明重組Asp f3和截短Asp f3(去除了IgE結(jié)合位點(diǎn))均可提高皮質(zhì)類(lèi)固醇免疫抑制小鼠在煙曲霉孢子肺感染中的存活率(40%)［11－13］。而Chaudhary等［4］用ELISPOT方法進(jìn)一步證實(shí)，Asp f3和Asp f9/16可誘導(dǎo)健康人PBMC產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答。與Asp f3和Asp f9/16相比，煙曲霉TR抗原也可刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1性應(yīng)答，與前者無(wú)顯著差異;且TR幾乎不刺激機(jī)體產(chǎn)生Th2型應(yīng)答，優(yōu)于Asp f3和Asp f9/16。這可能是因?yàn)锳sp f3和Asp f9/16本身是煙曲霉變應(yīng)原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，而TR不屬于煙曲霉的變應(yīng)原，過(guò)敏性肺曲霉病患者的血清中幾乎檢測(cè)不到抗TR的IgE型抗體［14］。

綜上所述，煙曲霉TR抗原可刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1型應(yīng)答且?guī)缀醪划a(chǎn)生Th2型應(yīng)答，表明TR抗原具有作為保護(hù)性抗原的潛能;但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)加以驗(yàn)證。

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