彭瑛，黃遠(yuǎn)帥，鄧正華，程松，溫先勇，王開正

0 引言

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一種常見的且經(jīng)常導(dǎo)致精神致殘的慢性大腦疾病，具有多種臨床癥狀［1］。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計，全世界SZ患者約5000萬，且發(fā)病率仍在逐年遞增［2］。SZ的診斷和療效觀察對于臨床和司法鑒定仍然是一件棘手的問題，目前主要根據(jù)復(fù)雜的臨床癥狀，如意識障礙、智能障礙、情感、行為等主觀指標(biāo)來判斷，而這些癥侯群多和其他精神疾病交叉出現(xiàn)并發(fā)生重疊。因此，早期、快速、客觀地實(shí)現(xiàn)SZ的正確診斷，是精神病學(xué)研究領(lǐng)域中的一大難題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄后

基因調(diào)節(jié)和相關(guān)的非編碼小分子RNA(microRNA，miRNA)可能是一個新的重要的與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)的調(diào)節(jié)因子。研究表明miRNA在SZ的不同腦皮質(zhì)區(qū)和外周血單個核細(xì)胞中存在異常表達(dá)［3］，并可作為SZ診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究擬用miRNA芯片技術(shù)和RT-PCR方法對SZ血清miRNA表達(dá)譜及其臨床意義進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象精神分裂癥患者組(SZ組)來自2011年8月至2012年4月在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院精神科住院且臨床資料齊全的SZ患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合國際精神疾病分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第10版(ICD-10);②首次發(fā)病;③未接受抗精神病藥物治療;④無自知力。排除標(biāo)準(zhǔn):腦器質(zhì)性和軀體疾病所致的精神障礙患者。共收集10例患者，男性4例、女性6例，年齡14～48歲，平均年齡(31.1±11.7)歲。樣本的收集都經(jīng)本院精神科醫(yī)師協(xié)助取得患者本人或家屬同意。對照組10名健康人來自瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)生和門診健康體檢中心，自愿參與試驗(yàn)。男性5例、女性5例，年齡21～45歲，平均年齡(25.1±6.3)歲。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 篩選試劑和儀器總RNA的提取和miRNA的提取分別使用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒和Ambion公司的MirVana?microRNA提取試劑盒進(jìn)行;熒光標(biāo)記用Affymetrix?GeneChip?公司提供的FlashTagTMBiotin RNA標(biāo)記試劑盒(Genisphere，F(xiàn)T30AFYB);Invitrogen公司提供的染色和洗滌試劑盒;Affymetrix公司的GeneChip miRNA 2.0芯片(miRBase v 15.0)。儀器包括Affymetrix?Hybridization Oven 640，Affymetrix?Fluidics Station 450，Affymetrix?GeneChip?Scanner 3000。

1.2.2 RT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)的主要試劑和儀器總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒均由北京曠博生物技術(shù)有限公司提供，使用ABI7500FAST擴(kuò)增儀進(jìn)行RT-PCR進(jìn)行定量擴(kuò)增。

1.3 研究方法

1.3.1 血標(biāo)本的處理全部研究對象取清晨空腹靜脈血4 mL，靜置10 min后，4℃溫度下以1600×g離心力離心5 min分離血清，將血清放置在EP管中-80℃保存待用。

1.3.2 miRNA芯片檢測總RNA的提取和miRNA的標(biāo)記純化、芯片的雜交、圖像采集均按試劑說明書進(jìn)行，其檢測流程見圖1。

圖1 miRNA芯片檢測原理流程圖Figure 1 miRNA microarray principle flowchart

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證對芯片篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以確保芯片結(jié)果的可靠性。包括以下3個步驟:①miRNA的3′尾部添加Poly A，反應(yīng)體系20 μL包括10X buffer.E.coli poly(A)Polymerase 2.0 μL、10 mM ATP 2.0 μL、Nase Inhibitor 0.5 μL、Total RNA 1 μL、E.coli poly(A)Polymerase 0.5 μL和1 μL External Control 2，RNase-free water定容至最終體積20 μL，在PCR儀37℃孵育1 h。②cDNA鏈的合成。取出第1步的反應(yīng)管向每個反應(yīng)管中加入0.5 μL反轉(zhuǎn)錄引物(RT Primer)，在PCR儀70℃孵育5min，然后冰上保存至少5min待用。cDNA鏈的合成反應(yīng)體系為40 μL，括5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer 8.0 μL、10 mM dNTP 2.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、加Poly A尾反應(yīng)產(chǎn)物20.0 μL、RNase-free water 8.0 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1.0μL，在PCR儀中50℃孵育50min，反應(yīng)后70℃保溫15 min。③熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL包括第2步反應(yīng)獲取的cDNA樣本1.0 ng，10X UPM(10 μmol/L)2.0 μL、10X Gene specific primer(10 μmol/L)2.0 μL、2X qPCR Mix 10.0 μL、RNase-free water定容至最終體積20 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃15 s，60℃45 s，40個循環(huán)。熔解溫度循環(huán)參數(shù):95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用SAM(Significance Analysis of Microarrays)軟件統(tǒng)計分析2組間差異表達(dá)的miRNA。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件Kruskal Wallis H檢驗(yàn)對2組之間PCR定量結(jié)果進(jìn)行比較分析，漸進(jìn)性以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA的篩選使用SAM軟件進(jìn)行差異miRNA篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)包括|Score(d)|≥1.5，信度值q-value控制在5%以內(nèi)，變化倍數(shù)≥1.5或Fold Change≤0.667，樣本數(shù)≥3。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)篩選出3個差異表達(dá)的miRNA，其芯片信號結(jié)果見表1。

表1 芯片篩選出的3個差異表達(dá)miRNA探針信號結(jié)果Table 1 Three kinds of differentially expressed miRNA probe signal results

表1結(jié)果顯示，SZ組與對照組比較hsa-miR-1281呈高表達(dá)，變化倍數(shù)1.509;hsa-miR-2861、hsamiR-638成低表達(dá)，變化倍數(shù)分別為0.642、0.516。

2.2 實(shí)時定量PCR驗(yàn)證結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)溶解曲線和擴(kuò)增曲線結(jié)果顯示反應(yīng)過程順利，特異性較好，無非特異性擴(kuò)增，表明定量PCR結(jié)果可靠。以一定量的人工合成的類似miRNA的小分子片段作為外參，用2-Δct計算miRNA的相對表達(dá)量。其結(jié)果證實(shí)，hsa-miR-2861和hsa-miR-638在SZ患者中均成低表達(dá)，分別與健康受試者比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);hsa-miR-1281在SZ組呈明顯的高表達(dá)，與健康受試者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與芯片初篩結(jié)果一致，見表2。

表23 個miRNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果相對濃度比較(x±s)Table 2 The relative concentration of three miRNAs PCR validation results(x±s)

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)和相關(guān)的非編碼小分子RNA(miRNA)可成為一種與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子［3］。它們通過堿基互補(bǔ)與開放性閱讀框架和mRNA的3′-UTRs結(jié)合從而導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制。miRNA在器官形成、新陳代謝和神經(jīng)發(fā)育方面起著重要的作用。多種miRNA在大腦中選擇性表達(dá)，并在神經(jīng)元處理過程中表現(xiàn)為最基本的調(diào)節(jié)作用，包括維持神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄、樹突的長出和觸突的形成［4］。國外學(xué)者關(guān)于miRNA和SZ的相關(guān)研究已有大量文獻(xiàn)報道，但這些研究絕大部分都是基于SZ患者死亡后尸檢組織中異常miRNA的研究，外周血幾乎未涉及。Lai［5］等在2011年用外周血單個核細(xì)胞檢測出發(fā)現(xiàn)了7個miRNA(hsa-miR-34a、miR-449a、miR-564、miR-432、miR-548d、miR-572和miR-652)特征譜，該試驗(yàn)表明這7個異常表達(dá)的miRNA可作為診斷SZ的生物標(biāo)志物。

Gilad等［6］證實(shí)血清miRNA的變化可以反映人體病理生理狀況的改變。Chen等［7］報道m(xù)iRNA可以在血液中穩(wěn)定的獨(dú)立于血細(xì)胞之外的存在，血清中特定的miRNA可以作為腫瘤或其他疾病的診斷標(biāo)志物。Evan等［8］報道了使用qRT-PCR方法分析血清中循環(huán)miRNA。因此本研究對SZ患者血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究。

本試驗(yàn)通過芯片篩選、PCR驗(yàn)證。與健康受試者比較，在未接受過抗精神病藥物治療的SZ患者血清中發(fā)現(xiàn)了3個差異表達(dá)的miRNA，其中hsa-miR-1281高表達(dá)，hsa-miR-638和hsa-miR-2861低表達(dá)，表明了SZ患者血清中存在異常表達(dá)的miRNA。由于本試驗(yàn)是首次通過芯片篩選SZ血清中差異表達(dá)的miRNA，目前尚未了解異常表達(dá)的miRNA在SZ患者血清中的具體作用機(jī)制。文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)差異miRNA在SZ中的相關(guān)報道，但篩選出的部分miRNA在大腦發(fā)育以及神經(jīng)紊亂性疾病中的調(diào)控作用已有不少報道［9-14］。

Mukhopadhyay等［9］用包含609種鼠miRNAs的miRXploreTM技術(shù)分析了妊娠8.5d、9d和9.5d的老鼠胚神經(jīng)中miRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)管形成的關(guān)鍵時期存在著一系列獨(dú)特的miRNA基因表達(dá)譜，其中miR-638、miR-663、miR-762可能在胚神經(jīng)發(fā)育中存在關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Maes等［10］也闡明了miR-638、miR-663可作為神經(jīng)管發(fā)育中起關(guān)鍵作用，在神經(jīng)管發(fā)育過程中細(xì)胞內(nèi)增殖和凋亡的一個重要的調(diào)節(jié)因子。Santosh等［11］通過基因庫預(yù)測該疾病的疾病通路基因分析發(fā)現(xiàn)包括miR-638、miR-1469在帕金森病患者中有異常表達(dá)，可能在該病信號通路調(diào)控中有重要的作用。而從SZ的病因?qū)W［12］和影像學(xué)研究［13-14］提示神經(jīng)發(fā)育障礙可能是其發(fā)病機(jī)制之一，在基因和環(huán)境的共同影響下，大腦的正常發(fā)育受到不良影響，包括神經(jīng)元細(xì)胞的分化、遷移和凋亡等過程受損，使得在青春期大腦機(jī)能成熟的最后階段出現(xiàn)各種神經(jīng)精神障礙。這一點(diǎn)結(jié)合miR-638的研究成果分析，認(rèn)為低表達(dá)的miR-638可能與SZ發(fā)病機(jī)制和臨床癥狀有關(guān)。

通過靶點(diǎn)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase 5，HDAC5)是miR-2861在mRNA水平上的一個靶點(diǎn)。HDAC5在大腦前額的海馬體、腦皮質(zhì)和杏仁核等區(qū)含量極為豐富，在提高學(xué)習(xí)、記憶和突觸構(gòu)建方面有著重要的意義［15］。而有研究發(fā)現(xiàn)，可以通過HDAC5抑制劑參與腦皮質(zhì)神經(jīng)元中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)的調(diào)控［16］。BDNF對于大腦皮層的發(fā)育和成熟具有突出的作用。特別是在大腦發(fā)育期間其表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的紊亂，在成熟大腦中是引起適應(yīng)能力下降的一種潛在機(jī)制，使得大腦對神經(jīng)毒性的損傷更加敏感。盡管miR-2861與其靶點(diǎn)HDAC5在SZ中的具體作用機(jī)制還未見報道，但這些研究結(jié)果提示miR-2861的異常表達(dá)可能和SZ的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

通過靶點(diǎn)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)hsa-miR-638、hsa-miR-2861和hsa-miR-1281分別存在246、47和31個靶基因。但是由于時間和經(jīng)費(fèi)有限，目前還沒有對篩選出的miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)的驗(yàn)證，以及這些miRNA和臨床癥狀的研究。研究將在后續(xù)的工作中將加大標(biāo)本量對篩選出的miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證和體外試驗(yàn)，探索與SZ機(jī)制相關(guān)性，結(jié)合臨床病理資料分析其臨床意義。綜上所述，SZ患者血清中存在異常表達(dá)的miRNA，可能是診斷SZ的一個新的標(biāo)志物，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究探討。

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