韓姍姍, 李 輝, 黨翔吉, 牛倩倩, 陳夢鈺, 焦海勝

（1.蘭州大學藥學院, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部, 甘肅 蘭州 730030）

銀屑片治療小鼠銀屑病的實驗研究

韓姍姍1, 李 輝1, 黨翔吉1, 牛倩倩1, 陳夢鈺1, 焦海勝2*

（1.蘭州大學藥學院, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部, 甘肅 蘭州 730030）

目的 考察銀屑片 （萆薢、 當歸、 紅花、 梔子等） 對銀屑病樣小鼠模型的治療作用。 方法 采用咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣模型及鼠尾鱗片顆粒層模型，觀察銀屑片對皮損形態(tài)學變化及對表皮顆粒層形成的影響。結果 咪喹莫特模型組小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、皮膚增厚現(xiàn)象，皮損組織表現(xiàn)為棘層增厚、角化不全。與模型組相比，銀屑片各劑量組小鼠銀屑病樣皮損癥狀減輕， 銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度 （PASI） 評分降低， 角化不全和表皮增厚現(xiàn)象得到改善， 增殖細胞核抗原 （PCNA） 的表達有所降低。 與正常對照組相比， 銀屑片各劑量組對小鼠鼠尾鱗片顆粒層的形成有促進作用。結論 銀屑片對上述小鼠銀屑病模型具有一定的治療作用。

銀屑片;銀屑病;小鼠

銀屑病是一種常見且易復發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，也是一種多基因遺傳背景下發(fā)生的由T細胞介導的免疫性疾?。?-3］。 銀屑病 的基本 病理特點為表皮細胞過度 增 殖 和角化不全。 咪 喹 莫特 （ imiquimod， IMQ） 是 Toll樣受體 （ Toll-like receptor，TLR） -7/8 的免疫激活劑［4］， 可誘導小鼠出現(xiàn)銀屑病樣皮損癥狀和 組織學 改變［5-8］。 成 年小鼠尾部鱗片表皮呈不全角化，類似銀屑病角化不全病理生理改變。銀屑片由萆薢、當歸、紅花、梔子等中藥制成，具有瀉火除煩、清熱涼血、活血驅風等功能， 臨床用于銀屑病的治療取得滿意療效［9-10］。 本實驗采用咪喹莫特誘導的小鼠皮膚銀屑病樣皮損模型和鼠尾鱗片顆粒層模型，觀察銀屑片的療效，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠， 體質量 （20 ± 2） g， 由蘭州大學動物實驗中心提供，合格證書號:SCXK（甘） 200806。

1.2 藥品與試劑 銀屑片 （蘭州大學第二醫(yī)院制劑室， 批號 20130426）; 雷公藤多苷片 （安徽新隴海藥業(yè)有限公司產(chǎn)品， 批號 130201）;5%咪喹莫特乳膏 （湖北科益藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品， 批號130303）; 兔抗增殖細胞核抗原 （PCNA） 多克隆抗體 （武漢三鷹生物技術有限公司）; 兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒 SP-9001 （北京中杉金喬生物技術有限公司）。

1.3 實驗儀器 GTZA型精密電子天平;BX-50 奧林巴斯顯微鏡;切片機;自動封閉式組織脫水機;包埋機;病理組織漂烘機。

2 方法與分組

2.1 咪喹莫特模型分組 取 48 只昆明種小鼠背部除毛后單籠飼養(yǎng)。隨機分為6組，即正常對照組，模型組，銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷陽性藥物對照組。 各組小鼠 （除正常對照組） 背部每日涂抹 5%咪喹莫特乳膏 42 mg， 同時灌胃給藥，每天2次，連續(xù)8 d: 正常對照組與模型組給予等容積生理鹽水;中劑量的選擇按照不同種屬動物間等效劑量的直接折算公式計算，高、中、低劑量選擇4 ∶2 ∶1 的比例， 則銀屑片高、 中、 低劑量組分別給予銀屑片溶液 0.68 g生藥/（kg·d）、 0.34 g生藥/（kg·d）、 0.17 g生藥/（kg·d）; 雷公藤多苷片 組給予雷公藤 多苷片 溶液 0.094 g生藥/（kg·d）。

2.2 鼠尾鱗片顆粒層模型分組 正常小鼠尾部鱗片表皮天然缺少顆粒層，類似人類銀屑病表皮分化障礙的病理改變，故采用此模型來評價藥物促進顆粒層形成的作用。 取昆明種小鼠 40 只， 隨機分為5組，分別為正常對照組，銀屑片高、中、低劑量組，雷公藤多苷片組，每組8只。正常對照組給予等容積生理鹽水，銀屑片高、中、低劑量組分別給藥 0.68 g生藥/（kg·d）、 0.34 g生藥/（kg·d）、0.17 g生藥/（kg·d），雷公藤多苷片組 0.094 g生藥/（kg·d）。 每天 2 次， 連續(xù)灌胃 21 d。

3 檢測指標與方法

3.1 咪喹莫特模型檢測指標［11]

3.1.1 小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度（psoriasis area and severity index， PASI） 評分［5-6］觀察各組小鼠每天的皮損變化情況， 依據(jù) PASI評分標準 給 予 小 鼠 皮 損 處 紅 斑 （ erythema） 、 鱗 屑（scales）和浸潤增厚程度 （ thickness） 0 ～4 的積分:0， 無;1， 輕度;2， 中度;3，重度;4， 極重度。 將三者積分相加得到總積分 （0 ～12）， 對各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢線。

3.1.2 小鼠背部皮損病理學改變 采用蘇木精-伊紅 （HE） 染色觀察。剪取各組小鼠背部皮損皮膚固定于4%多聚甲醛， 經(jīng)脫水、 石蠟包埋、 切片、HE染色后觀察皮膚病理學改變， 并測量表皮厚度。

3.1.3 小鼠背部皮損 PCNA的表達 剪取各組小鼠背部皮損皮膚，進行包埋，石蠟切片經(jīng)抗原熱修復、 抗體孵育、 DAB顯色、 蘇木精復染， 同步設立陰性對照。

3.2 鼠尾鱗片顆粒層模型檢測指標

3.2.1 鼠尾鱗片顆粒層形成情況 末次給藥 24 h后處死小鼠， 在距尾根部約 2 cm處取背面皮膚一長條 （1.5 cm×0.2 cm）， 4%多聚甲醛固定， 石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察鼠尾鱗片顆粒層形成， 計數(shù)連續(xù)100 個鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)，并對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。

4 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件， 實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差 （）， 組間比較采用單因素方差分析方法， 以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

5 結果

5.1 咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣動物模型皮損的形態(tài)學變化 圖1可見，與正常對照組相比，咪喹莫特模型組在咪喹莫特涂抹1～2 d后皮膚即出現(xiàn)紅斑、 鱗屑及皮膚增厚現(xiàn)象，皮損癥狀在7～8 d最為嚴重，呈典型的銀屑病樣改變。隨著時間延長，模型組皮損日益嚴重:紅斑由少量淡粉色斑點變?yōu)榇竺娣e深紅偏棕褐色斑塊;鱗屑由瑣碎狀增多增厚，過渡至布滿裸露皮膚的層狀鱗屑;皮膚逐漸褶皺、隆起，增厚浸潤明顯。銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷組皮損癥狀與模型組相比明顯減輕，鱗屑較少，紅斑量少且色淺，增厚浸潤程度較輕。

5.2 銀屑片對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣動物模型皮損的病理學變化的影響 HE染色顯示:正常對照組小鼠皮膚可見菲薄的角質層、顆粒層、棘細胞層;咪喹莫特模型組小鼠皮膚過度角化、角化不全、棘層肥厚;銀屑片高、中、低劑量組小鼠皮膚角化過度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組， 見圖2。 通過測量表皮層厚度發(fā)現(xiàn): 模型組小鼠表皮層增厚明顯，銀屑片組表皮層增厚程度低，與模型組比較有顯著差異 （P＜0.05）， 見表1。

圖1 各組小鼠皮損積分趨勢Fig.1 PASI scores of mouse skin lesions induced by im iquimod

表1 各組小鼠治療8 d皮損處表皮層厚度的比較 （，n=8）Tab.1 Com parison of epiderm is thickness in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

表1 各組小鼠治療8 d皮損處表皮層厚度的比較 （，n=8）Tab.1 Com parison of epiderm is thickness in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

注: 與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥 劑量 /（ g·kg-1·d-1） 表 皮層厚 度 /μm正常組 生理鹽水 9.21 ±1.32*模型組 生理鹽水 82.37 ±11.05銀屑片高劑量組 0.68 40.40 ±5.77*銀屑片中劑量組 0.34 53.39 ±10.15*銀屑片低劑量組 0.17 59.34 ±9.87*雷公藤多苷片組 0.094 38.80 ±7.59*

5.3 銀屑片對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣動物模型皮損 PCNA的表達的影響 正常對照組小鼠PCNA陽性表達僅限于表皮基底層， 呈線狀排列;咪喹莫特模型組陽性細胞不僅局限于基底層，表皮中下層也有表達，著色細胞層數(shù)和數(shù)量明顯增多;銀屑片高、中、低劑量組著色細胞層數(shù)較模型組少，見圖3。 經(jīng)統(tǒng)計學分析， 與模型組比較銀屑片組 PCNA表達顯著降低 （P＜0.05）， 見表 2。

圖 3 各組小鼠治療 8 d皮損處 PCNA的表達 （ ×400）Fig.3 PCNA expression of skin lesions at day 8 of treatment（ imm unohistochem ical staining， ×400）

表2 各組小鼠治療8 d皮損處 PCNA的表達 （， n=8）Tab.2 Expression of PCNA in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

表2 各組小鼠治療8 d皮損處 PCNA的表達 （， n=8）Tab.2 Expression of PCNA in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

注: 與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥 劑量 /（ g·kg-1·d-1） PCNA/%正常組 生理鹽水 4.62 ±1.51*模型組 生理鹽水 11.88 ±3.87銀屑片高劑量組 0.68 6.12 ±1.25*銀屑片中劑量組 0.34 7.50 ±3.07*銀屑片低劑量組 0.17 8.12 ±2.03*雷公藤多苷片組 0.094 7.12 ±2.75*

5.4 銀屑片對鼠尾鱗片顆粒層形成的影響 結果表明，正常對照組缺乏或僅有少量的顆粒層，銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷片組顆粒層細胞均有不同程度的增加，促進表皮正常分化。與對照組相比，銀屑片高、中、低劑量組均可顯著促進鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （P＜0.05）， 且有良好的量效關系，見表3。

表3 各組小鼠鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （， n=8）Tab.3 Formation of granular layer in scale ep iderm is of m ice tails（， n=8）

表3 各組小鼠鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （， n=8）Tab.3 Formation of granular layer in scale ep iderm is of m ice tails（， n=8）

注: 與對照組比較，*P＜0.05

個鱗片對照組 生理鹽水組別 給藥劑量/（ g·kg-1·d-1）有顆粒層的鱗片數(shù)/ 100 8.12 ±2.59銀屑片高劑量組 0.68 18.75 ±3.28*銀屑片中劑量組 0.34 16.62 ±4.13*銀屑片低劑量組 0.17 14.38 ±5.26*雷公藤多苷片組 0.094 20.38 ±6.14*

6 討論

咪喹莫特是 Toll樣受體激動劑。 近年臨床應用時發(fā)現(xiàn)在咪喹莫特外用治療已控制良好的銀屑病患者合并的日光性角化病及基底細胞癌時，可誘導或加重原有 銀屑 病 病 情［12-14］。 研究 進 一 步發(fā) 現(xiàn) 咪 喹莫特外用于小鼠皮膚可誘導出典型銀屑樣炎癥［5-8］。 鼠尾鱗片因 表皮正 常角化缺乏顆粒層， 為自然角化異常，類似銀屑病角化不全病理生理改變。 Jarrett［15］和 Spearman 等［16］最早提出利用鼠尾鱗片表皮天然的角化形式模擬銀屑病表皮角化不全的特點。這兩種動物模型模擬了人類銀屑病的某些病理生理學改變，可應用于抗銀屑病藥物的篩選。

咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣動物模型有時間窗的限制，可認為前8 d為疾病的發(fā)生、發(fā)展階段［17］。咪喹莫特模型組小鼠在涂藥 2 d 后即出現(xiàn)淡紅色斑點、片狀鱗屑和皮膚褶皺浸潤現(xiàn)象。隨著藥物作用，紅斑增多且顏色變深，鱗片堆積漸成層，皮膚浸潤增厚， 皮損癥狀在7～8 d最為嚴重。結果表明銀屑片能使咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損癥狀得到明顯緩解， PASI評分顯著降低， 組織形態(tài)變化趨于正常， 降低皮損中 PCNA的表達水平。并能顯著促進鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成，改善角化不全癥狀。因此研究認為銀屑片對于銀屑病癥狀有很好的改善作用。此研究為臨床使用銀屑片治療銀屑病提供理論依據(jù)，而在治療銀屑病過程中銀屑片干預作用的靶點和通路將是今后繼續(xù)研究的方向和重點。

［ 1 ］ Mrowietz U， Reich K.Psoriasi-new insights into pathogenesis and treatment［J］ .Deutsches Arzteblatt Inter， 2009， 106（1/2） : 11.

［ 2 ］ Flatz L， Conrad C.Role of T-cell-mediated inflammation in psoriasis:pathogenesis and targeted therapy［ J］ .Psoriasis: Targets Therapy， 2013 ， 3:1-10.

［ 3 ］ Cai Y， Fleming C， Yan J.New insights of T cells in the pathogenesis of psoriasis［ J］ .CellMole Immunol， 2012， 9（4） :302-309.

［ 4 ］ Lowes M A， Russell C B， Martin D A， et al.The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses［ J］ .Trends Immunol， 2013， 34（4）:174-181.

［ 5 ］ van der Fits L， Mourits S， Voerman JS A， et al.Imiquimodinduced psoriasis-like skin inflammation in mice ismediated via the IL-23/IL-17 axis［ J］ .J Immunol， 2009， 182 （ 9 ） : 5836-5845.

［ 6 ］ Baek JO， Byamba D， Wu W H， et al.Assessment of an imiquimod-induced psoriatic mouse model in relation to oxidative stress［ J］ .Arch Dermatol Res， 2012， 304（9） :699-706.

［ 7 ］ Van Belle A B， de Heusch M， Lemaire M M， et al.IL-22 is required for imiquimod-induced psoriasiform skin inflammation in mice［ J］.J Immunol， 2012， 188（1） :462-469.

［ 8 ］ 賴奇?zhèn)?咪喹莫特誘發(fā)銀屑病的機制研究新進展［J］.中國當代醫(yī)藥， 2013， 20（20）:25-27.

［9］ 唐富山， 焦海勝， 邱 雯， 等.銀屑片質量標準的研究［ J］ .中成藥， 2005， 27（3） :285-288.

［10］ 王 翼， 焦海勝， 邱雯.正交設計優(yōu)選銀屑片的提取工藝［ J］ .中國藥師， 2006， 9（10） :920-922.

［11］ 底婷婷， 趙京霞， 王 燕， 等.涼血活血膠囊對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損的干預作用［J］.中國病理生理雜志， 2012， 28（4）:718-722.

［12］ Rajan N， Langtry JA A.Generalized exacerbation of psoriasis associated with imiquimod cream treatment of superficial basal cell carcinomas［ J］ .Clin Exp Dermatol， 2006， 31 （ 1 ） : 140-141.

［13］ Fanti P A， Dika E， Vaccari S， et al.Generalized psoriasis induced by topical treatment of actinic keratosis with imiquimod［ J］ .Inter JDermatol， 2006， 45（12） :1464-1465.

［14］ Patel U， Mark NM， Machler BC， etal.Imiquimod 5%cream induced psoriasis:a case report， summary of the literature and mechanism［ J］ .British JDermatol， 2011， 164（3） :670-672.

［15］ Jarrett A.The physiology and pathophysiology of the skin［ J］，London:Academic Press， 1973:123.

［16］ Spearman R I C， Jarrett A.Biological comparison of isomers and chemical formsof vitamin A（retinol） ［ J］ .British JDermatol， 1974， 90（5） :553-560.

［17］ 趙京霞， 底婷婷， 王 燕， 等.IL-23/IL-17 炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用［J］.中國病理生理雜志， 2013， 29（6）:1086-1094.

Effects of Yinxie Tablets on m ice w ith psoriasis

HAN Shan-shan1， LIHui1， DANG Xiang-ji1， NIUQian-qian1， CHEN Meng-yu1， JIAOHai-sheng2*

（1.College of Pharmacy， Lanzhou University， Lanzhou730000， China;2.Maternity Department， The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

AIM To evaluate the effects of Yinxie Tablets（ Angelicae sinensis Radix， Carthami Flos， Cardeniae Fructus， etc.） on mice models for psoriasis.METHODS Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation and the formation of scale epidermis granular layer inmouse tailwere used to study the therapeutic effects of Yinxie Tablets.RESULTS Compared with the model group， the cutaneous symptoms in Yinxie Tablets groups were alleviated， with psoriasis area and severity index（ PASI） scores decreased， epidermal parakeratosis and epidermal over-proliferation relieved， the expression of PCNA decreased.Compared with the normal group， the formation of scale epidermis granular layer inmouse tail in Yinxie Tablets groupswaspromoted.CONCLUSION Yinxie Tablets exhibit beneficial therapeutic effects on both psoriasismodels.

Yinxie Tablets;psoriasis;mice

R285.5

:A

1001-1528（2014）12-2463-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.004

2013-11-24

韓姍姍 （1989—）， 女， 碩士生， 從事臨床藥學研究工作。 Tel: （0931） 8942753

*通信作者: 焦 海勝 （1962 —） ， 男， 教 授， 碩 士生導 師， 主要 從事 新劑 型和臨 床藥 學研究 工 作。 Tel: （ 0931 ） 8942571 ， E-mail: ldeyjhs@sohu.com