劉星雨, 吳 娜, 張 嬌, 吳 瑤, 羅 盼, 王偉男, 魏 淵

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

生、 炙甘草對小鼠 CYP3As及對雷公藤內(nèi)酯醇解毒的比較

劉星雨, 吳 娜, 張 嬌, 吳 瑤, 羅 盼, 王偉男, 魏 淵*

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

目的 研究生、 炙甘草對細胞色素 P450 酶系的調(diào)節(jié)作用和對雷公藤內(nèi)酯醇解毒效果。 方法 分別使用生、 炙甘草水提液灌胃 C57BL/6 小鼠達 15 d， Western blot方法檢測小鼠肝微粒體中 CYP3As和 CYPOR的水平。 同樣水提液灌胃 C57BL/6 小鼠達 10 d， 觀察小鼠臟器指數(shù)、 血液組織生化指標(biāo)和病理切片對雷公藤內(nèi)酯醇的解毒效果。 結(jié)果 與雷公藤內(nèi)酯醇組相比， Western blot凝膠掃描半定量分析表明生甘草 （P＜0.01） 和炙甘草組 （ P＜0.05） 均可明顯誘導(dǎo)小鼠肝臟 CYP3As。 血清和組織生化指標(biāo)， 臟器指數(shù)和病理切片顯示生、 炙甘草均可降低雷公藤內(nèi)酯醇毒性， 顯著緩解雷公藤內(nèi)酯醇導(dǎo)致的睪丸萎縮 （P＜0.01）， 降低雷公藤內(nèi)酯醇組小鼠肝、 腎和睪丸病變程度均有病理變化。 結(jié)論 生甘草對 CYP3As誘導(dǎo)和對雷公藤內(nèi)酯醇的解毒作用比炙甘草顯著。

生甘草; 炙甘草; 雷公藤內(nèi)酯醇;CYP3As; 毒性; 解毒

甘草作為中國傳統(tǒng)草藥材，使用歷史源遠流長，根據(jù)中藥配伍理論中甘草具有 “調(diào)和諸藥，緩解藥物毒性、烈性”的特點，因此大多數(shù)中藥處方中都有甘草，故而有 “國老”、 “十方九草”的美譽。甘草分為生甘草和炙甘草兩種，生甘草性味甘、平，能補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥。其藥性偏涼，主治瀉火解毒、化痰止咳，用于痰熱咳嗽，咽喉腫痛，癰阻瘡毒，食物中毒及藥物中毒。炙甘草性平偏溫，主治補脾合胃、益氣復(fù)脈，用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心動悸，脈結(jié)代。

細胞色素 CYP450 是體內(nèi)內(nèi)外源性化合物的 I相生物轉(zhuǎn)化中最重要的酶系，在藥物代謝和解毒作用方面具有重要作用。 其中 6 種重要的 CYP450 亞型:CYP3A4、 CYP2D6、 CYP2C9、 CYPlA2、CYP2C19、 CYP2EI參與了 90%的臨床藥物的代謝， 其中以 CYP3A4 代謝范圍最為廣泛， 約占藥物代謝的 50%［1］。 近年來國內(nèi)外有很多文獻報道了中藥如黃梔子［2］、 人參［3］和葛根［4］等或中藥有效成分如水飛薊素［5］等對細胞色素 P450 酶存在誘導(dǎo)或抑制作用。就甘草而言，已有文獻報道甘草通過誘導(dǎo)肝藥酶 CYP3A4、 CYP2B1、 CYP1A2 等起到解毒的作用［6］， 為甘草的解毒機制研究提供了新的思路。然而在實際應(yīng)用中，究竟是生甘草還是炙甘草的誘導(dǎo)作用更為有效，還沒有答案。本研究嘗試使用分子生物學(xué)的方法給出明確解答，并使用雷公藤內(nèi)酯醇作為模型藥物來驗證兩者解毒效果的差異。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備 TY-80S 脫色搖床 （南京新校園生物技術(shù)研究所）;THZ-82B氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市醫(yī)療儀器廠）;BSA124S 電子天平;賽多利斯科學(xué)儀器［（北京） 有限公司］;IKA磁力攪拌器 （ RCT basic） （ 德國 IKA）;FE20 PH計［梅 特 勒-托 利 多 儀 器 （ 上 海 ） 有 限 公 司 ］; DT100G&G精密電子天平 （上海麗度電子科技發(fā)展有限公司）;PICO17 離心機 （Thermo Fisher）; SK-1 快速混勻器 （江蘇中大儀器廠）;CS-300V穩(wěn)壓電源儀 （英國 CLEAVER）; 電濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng) （英國 CLEAVER）; 垂直電泳槽 （英國 CLEAVER）。

1.2 主要試劑 生、 炙甘草購買于安徽海鑫中藥飲片有限公司， 合格證號皖 2010019，經(jīng)江蘇大學(xué)歐陽臻教授鑒定為為豆科植物光果甘草 Clycyrrhiza glabra L.的干燥根及 根 莖， 藥材標(biāo)本存放于江蘇大學(xué)藥學(xué)院生藥標(biāo)本室。雷公藤內(nèi)酯醇（純度大于 99%） 購買于 Chroma Dex。 兔抗小鼠CYP3As和 CYPOR抗 體 為 Santa Cruz公 司 產(chǎn) 品。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG、 BCA蛋白濃度試 劑 盒、 BeyoECL Plus發(fā) 光 液、SDS-PAGE緩沖液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、TEMED購買于碧云天生物 技 術(shù) 研 究 所。 谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶 （ alanine amin-otransferase， ALT）、 谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶 （ glutamic-oxaloacetic transaminase， AST） 、尿 素 氮 （ blood ureanitrogen， BUN）、 還 原 型 谷 胱 甘 肽 （ glutathione，GSH） 和丙二醛 （ malondialdehyde， MDA） ELISA檢測試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。其余為國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純或生化級試劑。

1.3 藥品的配制

1.3.1 生、 炙甘草藥液制備 取生、 炙甘草等量藥材， 加 10 倍量水， 浸泡 1 h，回流提取 3 次，第 1 次 1.5 h， 后 2 次 1 h， 合并 3 次濾液，減壓濃縮至每毫升藥液分別相當(dāng)于 0.5 g生、 炙甘草生藥。

1.3.2 雷公藤內(nèi)酯醇注射液 精密稱取雷公藤內(nèi)酯醇充分溶解于吐溫 80，再以氯化鈉注射液稀釋至所需濃度， 吐溫 80 在終溶液中比例不超過 1%（V/V）， 4 ℃冰箱保存。

1.4 實驗動物 本實驗應(yīng)用的 C57BL/6 小鼠購買于南京大學(xué)模式動物研究所， 合格證號:SCXK（蘇） 2010-0001， 體質(zhì)量 18 ～22 g， 雄性， 8 周大小。購買后在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于正式實驗， 室溫22 ～25 ℃， 相對濕度 65%，12 h 明暗交替照明，自由進食、飲水。

1.4.1 甘草灌胃實驗 將 C57BL/6 小鼠分別完全隨機分為4個實驗組，每組3只，分別設(shè)為空白對照組，生甘草組、炙甘草組、苯巴比妥誘導(dǎo)組。給藥期限為15 d， 給藥方式為每 24 h 灌胃給藥 1 次，劑量依次為: 空白對照組， 用 0.9%氯化鈉注射液作空白對照，按體質(zhì)量給予相當(dāng)量的對照液;生甘草組和炙甘草組按 7.5 g/kg分別灌胃給藥生甘草和炙甘草溶液; 苯巴比妥組， 按 5 g/kg， 灌胃給藥苯巴比妥生理鹽水溶液。末次給藥后，隔天禁食12 h， 稱定質(zhì)量后用二氧化碳窒息法處死小鼠。

1.4.2 甘草灌胃對雷公藤內(nèi)酯醇的解毒實驗 將C57BL/6 小鼠完全隨機分為 4 個實驗組組， 每組10只， 分別設(shè)為空白對照組， 生甘草組、 炙甘草組、雷公藤內(nèi)酯醇組。對生甘草組、炙甘草組每24 h灌胃給生甘草、 炙甘草 1 次，給藥期限為10 d。隨后生甘草組、 炙甘草組、 雷公藤內(nèi)酯醇組每48 h腹腔注射給藥雷公藤內(nèi)酯醇 1 次， 同時生甘草組、 炙甘草組每48 h灌胃給生甘草、 炙甘草1次， 與雷公藤內(nèi)酯醇注射每 24 h間隔。雷公藤內(nèi)酯醇溶液劑量: 按 300 μg/kg（3/10 LD50） 腹腔注射?？瞻讓φ战M、甘草給藥劑量與處死方法同上。

1.5 觀察指標(biāo)和方法

1.5.1 Western blot測 定 肝 微 粒 體 中 CYP3As和CYPOR水平 甘草灌胃實驗中小鼠于末次給藥的次日二氧化碳窒息法處死，開腹后迅速摘除肝臟并用生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，剪碎肝組織并稱重，加 入 50 mmol/L PBS 溶 液 （ 含 KCl 150 mmol/L，蔗糖250mmol/L， pH 7.5）， 制成 5% 組織勻漿。 勻漿液在 9 000 ×g 離心 20 min; 上清液100 000 ×g 超速離心 60 min， 得到肝微粒體沉淀。以上操作均在低溫 （4℃）下進行。 于肝微粒體蛋白中加入 80 mmol/L PBS 溶液 （含 20%甘油， pH 7.5） 溶液懸浮， 貯藏于 -80 ℃冰箱中備用。

1.5.2 血清生化指標(biāo)的測定 實驗結(jié)束后， 將 4組小鼠每只小鼠以二氧化碳窒息法處死。心臟取血， 室溫血液自然凝固 2 h， 離心 20 min （900 × g） 收集上清， 放于 -80 ℃保存直至分析。 測定血清 ALT、 AST、 MDA及 BUN， 分別用于了解肝功能、腎功能及睪丸功能。

1.5.3 組織中的生化指標(biāo)的測定 處死后的小鼠，取其各臟器稱定質(zhì)量后， 將肝臟 （3/4）、 腎 （1/ 2）、 睪丸 （1/2） 凍于 -80 ℃冰箱中待用。 準(zhǔn)確稱取各組織的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加9倍的生理鹽水制成 10%的勻漿， 900 ×g 離心 10 min， 取上清待測。 測定各組織中的 ALT、 AST、 MDA及 GSH值進一步了解各組織功能。

1.5.4 臟器指數(shù)的測定 實驗結(jié)束后， 稱取所有動物的體質(zhì)量，并將肝臟、脾臟、腎及雙側(cè)睪丸稱定質(zhì)量，求臟器指數(shù)，計算公式如下:臟器比（%） = （個體臟器質(zhì)量/個體質(zhì)量） ×100。 觀察藥物對各臟器的影響，進行初步的毒性判斷。

1.5.5 病理組織切片觀察 實驗結(jié)束后， 將各組織器官剔除脂肪組織及筋膜后稱定質(zhì)量后，取肝臟、 腎、 睪丸 3 個器官， 隨即放入裝有 10%中性福爾馬林固定液的標(biāo)本瓶中浸泡固定， 48 h后作病理組織學(xué)檢查，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片 （5 μm厚）， H&E染色， 光鏡觀察各個器官組織形態(tài)學(xué)變化及黏膜、黏膜下間質(zhì)形態(tài)學(xué)的改變。

2 結(jié)果

2.1 生、 炙 甘 草 對 CYP3As的 誘 導(dǎo) 作 用 從Western blot結(jié)果 （圖 1， 表 1 ～2） 可見， 生、 炙甘草對 CYP3As均有誘導(dǎo)作用， 但對 CYPOR （細胞色素 P450 氧化還原酶） 無明顯作用。 對其進行凝膠掃描半定量分析可知生甘草對 CYP3As誘導(dǎo)明顯， 炙甘草對 CYP3As誘導(dǎo)較明顯， 兩者均同 CYP3As強誘導(dǎo)劑苯巴比妥存在顯著差別。 對于 CYPOR， 生甘草、 炙甘草和苯巴比妥無明顯差別。

圖 1 空白組、 生甘草組、 炙甘草組和苯巴比妥組 CYP3As和 CYPOR蛋白表達的 Western blot檢測結(jié)果 （每孔10 μg）Fig.1 W estern blot results of CYP3As and CYPOR expressions in vehicle， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma.phenobarbital treatments（10 μg per punch）

表 1 ImageJ2x 掃 描 空 白 組、 生 甘 草 組 和 苯 巴 比 妥 組W estern blot檢 測 結(jié)果的數(shù) 據(jù) 分析 （n=3，）Tab.1 W estern b lot results measured by ImageJ2x including vehicle， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and phenobarbital treatments（n=3，）

表 1 ImageJ2x 掃 描 空 白 組、 生 甘 草 組 和 苯 巴 比 妥 組W estern blot檢 測 結(jié)果的數(shù) 據(jù) 分析 （n=3，）Tab.1 W estern b lot results measured by ImageJ2x including vehicle， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and phenobarbital treatments（n=3，）

注: 與空白對照組比較，**P＜0.01

CYP3As CYPOR空白組組別28.8 ±5.6 173.1 ±12.8生甘草組 53.2 ±3.3** 161.9 ±8.5苯巴比妥組 84.9 ±6.1**163.2 ±10.7

表 2 ImageJ2x 掃 描 空 白 組、 炙 甘 草 組 和 苯 巴 比 妥 組W estern blot檢 測 結(jié)果的 數(shù) 據(jù) 分析 （n=3，）Tab.2 Western b lot resultsmeasured by ImageJ2x including vehicle， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and phenobarbital treatments（n=3，）

表 2 ImageJ2x 掃 描 空 白 組、 炙 甘 草 組 和 苯 巴 比 妥 組W estern blot檢 測 結(jié)果的 數(shù) 據(jù) 分析 （n=3，）Tab.2 Western b lot resultsmeasured by ImageJ2x including vehicle， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and phenobarbital treatments（n=3，）

注: 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

CYP3As CYPOR空白組組別42.5 ±7.6 140.7 ±20.1炙甘草組 66.4 ±3.4* 139.8 ±25.3苯巴比妥組 88.8 ±8.6**134.6 ±11.7

2.2 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠血清生化指標(biāo)的影響 生、炙甘草同時雷公藤內(nèi)酯醇給藥對 C57BL/6 小 鼠 血 清 肝 功 能 指 標(biāo) ALT， AST，GSH， MDA和腎臟功能指標(biāo) BUN的影響， 見表 3。與溶劑對照組相比， 生甘草組除 BUN外均無顯著差異; 炙甘草血清中的 ALT、 MDA有顯著上升（P＜0.05）， BUN有極顯著上升 （P＜0.01）; 雷公藤內(nèi)酯醇組 ALT， AST有顯著上升， MDA、BUN有極顯著上升。說明雷公藤內(nèi)酯醇給藥已明顯導(dǎo)致小鼠肝功能代謝受損，腎小球尿素氮濾過率降低，而生、炙甘草在一定程度上對這兩個組織起到解毒保護作用，且生甘草強于炙甘草。

2.3 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠肝臟組織生化指標(biāo)的影響 生、炙甘草同時雷公藤內(nèi)酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠肝臟組織中 ALT、 AST、 GSH和 MDA的影響， 見表 4。與溶劑對照組相比， 生甘草組除 MDA外均有顯著降低; 炙甘草組的 ALT、GSH有顯著降低， AST有極顯著降低; 雷公藤內(nèi)酯醇組各指標(biāo)均極顯著降低。

表 3 生、 炙 甘 草 對雷公 藤 內(nèi)酯醇給 藥 小 鼠血清 ALT， AST， GSH， M DA及 BUN水 平的影響 （n=10，）Tab.3 E ffects of G lycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and trip tolide treatm ents on serum biochem ical parameters in the C57BL/6 m ice（n=10，）

表 3 生、 炙 甘 草 對雷公 藤 內(nèi)酯醇給 藥 小 鼠血清 ALT， AST， GSH， M DA及 BUN水 平的影響 （n=10，）Tab.3 E ffects of G lycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and trip tolide treatm ents on serum biochem ical parameters in the C57BL/6 m ice（n=10，）

注: 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與雷公藤內(nèi)酯醇組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 ALT/（ U·L-1） AST/（ U·L-1） GSH/（ μmol·L-1） MDA/（ nmol·m L-1） BUN/（ mmol·L-1）27.5 ±3.8 24.2 ±8.3 24.8 ±3.1 7.2 ±0.4 6.1 ±0.2生甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 31.6 ±5.3 27.7 ±3.7 33.8 ±6.8 7.4 ±1.5# 6.8 ±0.3*##炙甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 36.5 ±4.0* 31.2 ±7.0 34.8 ±6.1 8.1 ±0.2*# 8.2 ±0.5**##雷公藤內(nèi)酯醇組 42.1 ±6.4* 34.2 ±3.6* 44.8 ±9.6* 9.9 ±1.0** 11.3 ±1.3空白組**

表 4 生、 炙 甘 草對雷公 藤 內(nèi)酯醇給 藥 小鼠肝臟 組 織 ALT， AST， GSH及 M DA水 平的影響 （n=10，）Tab.4 E ffects of G lycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and triptolide treatmentson liver homogenates in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

表 4 生、 炙 甘 草對雷公 藤 內(nèi)酯醇給 藥 小鼠肝臟 組 織 ALT， AST， GSH及 M DA水 平的影響 （n=10，）Tab.4 E ffects of G lycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and triptolide treatmentson liver homogenates in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

注: 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與雷公藤內(nèi)酯醇組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 ALT/（ U·L-1） AST/（ U·L-1） GSH/（ μmol·g prot-1） MDA/（ nmol·mg prot-1）50.5 ±0.9 74.2 ±5.8 15.2 ±1.7 6.0 ±0.4生甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 46.5 ±2.3*## 62.9 ±3.5*# 12.1 ±1.5* 6.0 ±0.2##炙甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 46.0 ±5.3*# 57.1 ±1.7** 11.7 ±2.1* 6.3 ±1.5#雷公藤內(nèi)酯醇組 41.2 ±0.9** 55.1 ±4.4** 10.8 ±1.4* 7.5 ±0.2空白組**

2.4 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠腎臟、睪丸生化指標(biāo)的影響 生、炙甘草同時雷公藤內(nèi)酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠腎、 睪丸功能指標(biāo) GSH、MDA的影響見表 5。 與溶劑對照組相比， 生甘草組均無顯著差異; 炙甘草組僅睪丸組織中 GSH有極顯著降低; 雷公藤內(nèi)酯醇組腎臟組織中 GSH有顯著降低，睪丸組織中兩者均極顯著減低。

2.5 臟器指數(shù)的比較 雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性中毒及通過生、炙甘草解毒對 C57BL/6 小鼠各臟器指數(shù)的影響， 見表6。雷公藤內(nèi)酯醇組睪丸有極顯著萎縮，且脾臟極顯著增大。生、炙甘草組與溶劑對照組相比，睪丸有顯著性萎縮，但萎縮程度顯著小于雷公藤內(nèi)酯醇組，脾臟相對溶劑組未有明顯變化。

表 5 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠腎臟、 睪丸 GSH及 MDA水平的影響 （n=10，）Tab.5 Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and trip tolide treatments on kidney and testis homogenates in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

表 5 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠腎臟、 睪丸 GSH及 MDA水平的影響 （n=10，）Tab.5 Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and trip tolide treatments on kidney and testis homogenates in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

注: 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與雷公藤內(nèi)酯醇組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 （GSH/腎臟） /（ μmol·g prot-1）（MDA/腎臟）/（ nmol·mg prot-1）（GSH/睪丸） /（ μmol·g prot-1）（MDA/睪丸） /（ nmol·mg prot-1）16.9 ±2.6 2.6 ±0.8 8.7 ±0.8 3.5 ±0.4生甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 14.5 ±2.4## 2.8 ±0.5 7.6 ±0.4 3.3 ±0.8#炙甘草 +雷公藤內(nèi)酯醇組 17.8 ±0.2 2.2 ±0.4 6.6 ±0.8** 3.3 ±1.3雷公藤內(nèi)酯醇組 19.4 ±1.3* 2.4 ±0.5 6.4 ±0.9** 4.2 ±0.1空白組**

表6 生、炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠各臟器指數(shù)的影響Tab.6 Viscera index of the C57BL/6m ice adm inistered with Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and trip tolide by intraperitoneal or intragastic injection for 50 days

2.6 病理組織切片觀察 在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理切片，可見雷公藤內(nèi)酯醇給藥組小鼠的肝細胞發(fā)生水變性，細胞呈氣球樣，匯管區(qū)慢性炎伴纖維結(jié)締組織增生，周圍小膽管增生，結(jié)合肝臟組織生化指標(biāo)來看， 肝臟可能產(chǎn)生慢性炎癥 （見圖2）。 而雷公藤內(nèi)酯醇組小鼠睪丸組織也發(fā)生了明顯的病理變化，與正常組相比小鼠睪丸組織生精小管中原本可見的大量橢圓形精子僅殘余部分，睪丸間質(zhì)細胞受損， 顯示出局灶性生精小管萎縮 （見圖 3）。 雷公藤內(nèi)酯醇組小鼠腎組織中被大量炎性細胞浸潤， 腎小球病變梗死 （見圖 4）。 生、 炙甘草組對兩組織病理變化均有一定程度上的癥狀緩解，且生甘草緩解程度強于炙甘草。

3 討論

圖2 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.2 M icrograph of livers from a C57BL/6 rat treated w ith vehicle（ A）， G lycyrrhizae Radix et Rhizoma &triptolide（ B） ， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma&triptolide（ C） and 300 μg/kg triptolide（ D） （ ×100）

圖3 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠睪丸組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.3 M icrograph of testis from a C57BL/6 rat treated with vehicle（ A） ， Glycyrrhizae Radix etRhizoma& triptolide（ B） ， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma&triptolide（ C） and 300 μg/kg triptolide（D） （ ×100）

圖4 生、 炙甘草對雷公藤內(nèi)酯醇給藥小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.4 M icrograph of kidney from a C57BL/6 rat treated w ith vehicle（ A） ， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma& triptolide（ B） ， honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma&triptolide（ C） and 300 μg/kg triptolide（D） （ ×100）

甘草是中藥配伍方劑中最常用的解毒中草藥，本實驗通過采用標(biāo)準(zhǔn)自交系 C57BL/6 小鼠研究生、炙甘草對肝微粒體中 CYP3As的影響。 研究結(jié)果可見生甘草對 CYP3As的誘導(dǎo)效應(yīng)要強于炙甘草， 此結(jié)果第一次直接在分子水平上比較了生、炙甘草對CYP3As的誘導(dǎo)作用。 本實驗中的 Western blot無法使 用 β-Actin， Tubulin， GAPDH 等 常 見 細 胞 內(nèi)參，因為提取肝微粒體的過程中使得細胞破裂，胞質(zhì)內(nèi)的其他細胞器和蛋白等丟失導(dǎo)致沒有合適的物質(zhì)作為內(nèi)參。 不過在微粒體中 CYPOR （細胞色素P450 氧化還原酶） 表達均一， 不易受藥物影響，實驗結(jié)果亦顯示4 組樣本中 CYPOR沒有顯著差異，側(cè)面了反映實驗精度高，均一性和可重復(fù)性好。

實驗采用雷公藤內(nèi)酯醇作為模型藥物比較生甘草和炙甘草的解毒效果。雷公藤內(nèi)酯醇是衛(wèi)矛科屬植物雷公藤的主要有效成分，藥理和臨床試驗表明其具有抗腫瘤、 免疫抑制、抗炎［7］及抗生育［8］等生物活性。雷公藤內(nèi)酯醇具有較強的毒性，臨床不良反應(yīng)的發(fā)生頻率高達 45%［9］。 其不良反應(yīng)主要發(fā)生在消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓及血液系統(tǒng)，此外還可引起水腫、血糖升高、 復(fù)視等［10］。 報道已證實在人類和大鼠中肝臟CYP3As是導(dǎo)致雷公藤內(nèi)酯醇羥化的主要 P450酶［11］， 大鼠中 CYP3As的表達量與其對的雷公藤內(nèi)酯醇解 毒 效果 正 相 關(guān)［12-13］。本 實 驗 結(jié)果 已 初 步揭示生、 炙兩種甘草能夠誘導(dǎo) CYP3As表達， 因此選用雷公藤內(nèi)酯醇作為比較兩者解毒效果的藥物。

生、炙甘草與雷公藤內(nèi)酯醇同步給藥對C57BL/6 小鼠血清中生化指標(biāo)的影響結(jié)果和病理組織切片觀察也可以看出兩種甘草均能在一定程度上中和雷公藤內(nèi)酯醇毒性。與劉良等通過昆明種小鼠研究雷公藤內(nèi)酯醇毒性［14］相比， 本實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性中毒除了對 C57BL/6 小鼠睪丸、肝臟、腎臟各有損傷外，還導(dǎo)致小鼠脾臟腫大，該區(qū)別可能系品種差異導(dǎo)致。本研究結(jié)果與吳娜等人均采用同一品系小鼠［15］相比，除肝臟損傷明顯可能緣由給藥時間增長、劑量加大以外其余均一致。本實驗結(jié)果證明生甘草對雷公藤內(nèi)酯醇的解毒效果明顯由于炙甘草，在一定程度上解釋了傳統(tǒng)中醫(yī)理論中生甘草偏重于瀉火解毒、化痰止咳等作用，而炙甘草側(cè)重補脾和胃，益氣復(fù)脈等作用，為生、炙甘草的臨床用藥提供了新的參考依據(jù)。

［ 1 ］ Guengerich FP.Reaction and significance of cytochrome P-450 enzymes［ J］ .JBiol Chem， 1991， 266（16 ）:l0019-22.

［ 2 ］ Kim H J， Chun Y J， Park ， et al.Protection of rat livermicrosomes against carbontetrachloride-induced lipid peroxidatian by red ginseng saponin through cyrochrome P450inhibition ［ J］ . Planta Med， 1997， 63（5） :415-418.

［ 3 ］ Chang T K， Chen J， Benetton SA.In vitro effect of standardized ginseng extracts and individualgingsanosides on the catalytic activity of human CYP1A1， CYPlA2， andCYPlB1 ［ J］. Drug Metab Dispos， 2002， 30（4）:378-384.

［ 4 ］ Kang J J， Wang H W， Liu T Y ， et al.Modulation of cyro-chrome P-450-dependentmonooxygenases， glutathione and glutatbione S-mmgferase in rat liver by oenposide from Cardenia jasminoldes［ J］ .Food Chem Toxicol， 1997， 35 （ 10/11 ） : 957-965.

［ 5 ］ Guerra M C， Speroni E， Broccoli M ， et al.Comparison between Chinesemedical herb Pueraria lobata crude extract and itsmain isoflavone puerarin antioxidant properties and effecton rat liver CYP-catalysed drugmetabolism［ J］ .Life Sci， 2000，67（24）:2997-3006.

［ 6 ］ PaoliniM ， Pozzetti L， Sapone， etal.Effect of licorice and glycyrrhizin on murine liver CYP-dependent monooxygenases［J］ .Life Sci， 1998， 62（6） :571-82.

［ 7 ］ 夏志林， 鄭幼蘭.雷公藤內(nèi)酯醇的藥理和臨床研究［J］.中國藥理學(xué)通報， 1992， 8（6）:427-431.

［ 8 ］ Lue Y， Sinha Hikim AP， Wang C， etal.Triptolide:a potentialmale contraceptive［J］ .JAndrol， 1998， 19（4）:479-86.

［ 9 ］ Jiang M.Pharmacologicaland clinical study on polyglycoside of T ripterygium wilfordii Hook f［ J］ .Chin Med J（ Taipei） ， 1996， 57（4）:S35.

［10］ 梅之南， 楊祥良， 徐輝碧.雷公藤內(nèi)酯醇的藥理研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2003， 23（9）:557-558.

［11］ LiW， Liu Y， He YQ， etal.Characterization of triptolide hydroxylation by cytochrome P450 in human and rat liver microsomes［ J］ .Xenobiotica ， 2008 ， 38（12） :1551-1565.

［12］ Ye X， LiW， Yan Y， etal.Effects of cytochrome P4503A inducer dexamethasone on themetabolism and toxicity of triptolide in rat［ J］.Toxicol Lett， 2010 ， 192（2） :212-20.

［13］ Liu L， Jiang Z， Liu ， etal.Sex differences in subacute toxicity and hepatic microsomal metabolism of triptolide in rats［ J］. Toxicology， 2010， 271（1/2） :57-63.

［14］ 劉 良， 王戰(zhàn)勇， 黃光照， 等.雷公藤甲素亞慢性中毒對昆明種小鼠腎臟及睪丸的影響［J］.同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001， 30（3）:214-217.

［15］ 吳 娜， 劉星雨， 王篤軍， 等.雷公藤內(nèi)酯醇對 C57BL/6小鼠亞慢性毒性作用的研究［J］.中成藥， 2014， 36（5）: 904-908.

Effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma on m ouse liver CYP3As and detoxification of triptolide

LIU Xing-yu， WU Na， ZHANG Jiao， WU Yao， LUO Pan， WANGWei-nan， WEIYuan*

（ School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

ABSTRACT:AIM To study the effects of Clycyrrhizae Radix et Rhizoma and honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma on the induction ofmouse liver CYP3As and their detoxification of triptolide.METHODS The aqueous extracts of Clycyrrhizae Radix et Rhizoma and honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma were administrated to C57BL/6 mice by gastric gavage for 15 days， respectively.The expression ofmouse liver CYP3As and CYPOR were studied using Western blot.The detoxification of triptolide with Clycyrrhizae Radix et Rhizoma， honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma aqueousextracts for ten dayswere observed with regular approaches including viscera index，histopathologymethods，and biochemical indexes in blood and tissues.RESULTS The Western blot results showed thatmouse liver CYP3Aswere significantly induced in both Clycyrrhizae Radix et Rhizoma group （P＜0.01 ） and honey-fried group （ P＜0.05） as compared with triptolide group.The biochemical indexes in mouse serum and tissues showed that both Clycyrrhizae Radix et Rhizoma and honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma could relief the toxicity of triptolide.Viscera index， the histopathological analysis and pathological examination indicated thatboth Clycyrrhizae Radix et Rhizoma and honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma could markedly alleviate the testicular atrophy caused by triptolid （ P＜0.01） and reduce the pathological changes.CONCLUSION Clycyrrhizae Radix et Rhizoma is better than honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma in inducing CYP3As and detoxification of triptolide.

Clycyrrhizae Radix et Rhizoma;honey-fried Clycyrrhizae Radix et Rhizoma;triptolide;CYP3As; toxicity;detoxification

R285.5

:A

1001-1528（2014）12-2451-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.002

2013-11-08

國家自然科學(xué)基金青年項目（81102522）; 江蘇省自然科學(xué)基金項目 （BK2011473）

劉星雨 （1990—）， 女， 碩 士 生， 研 究 方 向: 中藥藥理毒 理， 藥物基因組學(xué)。 Tel: （ 0576 ） 88827187， E-mail:liuxingyu. 0406@163.com

*通信作者: 魏 淵 （1981—）， 男， 博士， 副教授， 研究方向: 細胞色素 P450 酶系相關(guān)的藥物代謝與毒理， 藥物基因組學(xué)。 Tel:（0511） 88791526 ， E-mail:ywei@ujs.edu.cn