姜 輝, 吳芙蓉, 高家榮*, 陳金鋒

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥 230031； 2.安徽省立醫(yī)院藥劑科, 安徽 合肥 230001）

疏肝健脾方對(duì) CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠尿液代謝組學(xué)的影響

姜 輝1, 吳芙蓉2, 高家榮1*, 陳金鋒1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥 230031； 2.安徽省立醫(yī)院藥劑科, 安徽 合肥 230001）

目的 觀察疏肝健脾方 （茵陳、 柴胡、 黃芪、 白芍、 枳殼、 白術(shù)、 豬苓、 茯苓、澤蘭） 對(duì)肝纖維化大鼠尿液代謝譜的影響并推測(cè)其作用機(jī)制。 方法 皮下注射 50%CCl4橄欖油溶液誘導(dǎo)肝纖維化的 SD大鼠隨機(jī)分為模型組和疏肝健脾方組， 并設(shè)正常組， 連續(xù)給藥 12 周后， 收集大鼠尿液， 用 GC-TOF/MS 技術(shù)結(jié)合主成分分析、 偏最小二乘方-判別模式、 正交偏最小二乘方-判別模式法鑒定其代謝譜化合物變化。 結(jié)果 模型組中的 2-羥基丁酸、 異亮氨酸、 beta-丙氨酸、氨基丙二酸、胞嘧啶、賴氨酸與正常組相比含有量顯著升高，疏肝健脾方能夠使6個(gè)生物標(biāo)志物向正常水平靠近。結(jié)論 疏肝健脾方對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)能量代謝、嘧啶合成代謝、氨基酸代謝有關(guān)。

疏肝健脾方; 肝纖維化; 代謝組學(xué);GC-TOF/MS

肝纖維化 （ hepatic fibrosis） 是各種損肝因素引起的一種組織損傷-修復(fù)應(yīng)答，以細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為其主要表現(xiàn)，是一切慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)［1］。 代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，系統(tǒng)研究病理生理刺激后代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)，與中醫(yī) 學(xué) 的 “整 體 觀 ” 思 想 相 吻 合［2-3］。因此，將代謝組學(xué)方法 “導(dǎo)入” 中藥作用機(jī)制研究，具有廣闊的運(yùn)用前景。

疏肝健脾方又名肝樂(lè)顆粒，為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療急慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化活動(dòng)期的特色院內(nèi)制劑，具有疏肝解郁、健脾滲濕、活血化瘀之功效。 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò) GC-TOF/ MS技術(shù)從代謝組學(xué)的角度， 探討疏肝健脾方抗肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠， 體質(zhì)量 （200 ±20） g，雄性， 由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， SPF級(jí)。 室溫18 ～22 ℃， 相對(duì)濕度40% ～60%， 動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥品與試劑 疏肝健脾方 （安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑， 批號(hào) 20121109），主要由茵陳、柴胡、黃芪、白芍、枳殼、白術(shù)、豬苓、茯苓、澤蘭等藥物組成。按處方比例稱取藥材，第1次加 10 倍量水， 煎煮 1.5 h; 第 2、 第 3 次加 8 倍量水， 煎煮 1.0 h; 合并提取液濾過(guò)， 靜置沉淀 48 h。 吸取上清液， 減壓濃縮至密度為 1.15 g/cm3的流浸膏，加入糊精作底料，噴霧干燥制粒即得。四氯化碳 （天津市富宇精田化工有限公司， 批號(hào)12020）;L-2-氯苯丙氨酸 （ 上海恒柏生物科技有限公司， 批號(hào) CAS103616-89-3）; 甲醇 （ 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 批號(hào) 20130129）; 三氯甲烷 （天津市福晨化學(xué)試劑廠， 批號(hào) 20100512）。

1.3 儀器 GL-20A全自動(dòng)冷凍高速離心機(jī) （湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠）;GC色譜儀 （ Agilent 7890A， Agilent， USA）; 質(zhì) 譜 儀 （ LECO Chroma TOF PEGASUS 4D， LECO， USA）;-80 ℃超低溫冰箱 （三洋公司）;37 ℃溫箱 （湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與給藥［4]SD大鼠， 雄性， 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、疏肝健脾方 （16.2 g/kg） 組。 除正常組外， 其余各組分別于大鼠背部皮下注射 50%CCl4（0.1 mL/100 g），正常組給予相應(yīng)橄欖油， 每周 2 次， 連續(xù) 12周。造模第1天起，疏肝健脾方組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，正常組、模型組給予等量溶媒，每天1次，連續(xù)12周。

2.2 肝組織病理學(xué)檢查 麻醉大鼠， 取固定部位肝組織， 置于4%多聚甲醛液中固定， 常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水、 透明、封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

2.3 尿液樣本的采集與制備 末次給藥后， 低溫下采集正常組、 模型組、 疏肝健脾方組大鼠 12 h尿液， 置于 -80 ℃冰箱中凍存，待測(cè)。 常溫下解凍， 混勻樣品， 取 100 μL，加入 10 μL尿素酶（160 mg/m L） 于 100 μL尿液樣本中， 振蕩混勻，37 ℃培養(yǎng)箱孵育 1 h; 再加入 0.35 m L甲醇-三氯甲烷混合液 （3 ∶1）， 再加入 50 μL L-2-氯苯丙氨酸， 漩渦混勻; 緊接著將樣本 4 ℃， 12 000 r/min離心 10 min; 移液管取出 0.35 m L上清于 2 mL進(jìn)樣瓶 （甲烷硅基化的） 中; 在真空濃縮器中干燥提取物; 向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑 （甲氧胺鹽酸鹽， 溶于吡啶 20 mg/mL），輕輕混勻后， 放入烘箱中37 ℃孵育2 h; 向每個(gè)樣品中迅速加入 100 μL BSTFA （含有 1%TCMS， v/v），將混合物 70 ℃孵育 1 h; 冷卻至室溫， 供 GC-MS分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Chroma TOF4.3X軟件和 LECOFiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫(kù)被用來(lái)進(jìn)行峰提取、 峰基線過(guò)濾和校準(zhǔn)、峰對(duì)齊、反褶積分析及峰識(shí)別和集成分析［5］。將共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入 DEMO （ Umetrics AB， Umea， Sweden） 軟件， 經(jīng)歸一化處理后進(jìn)行 （ Principal Component Analysis， PCA）、 （ Partial Least Squares-Discriminate Analysis，PLS-DA）、（Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis， OPLS-DA） 模式識(shí)別分析; 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Student-t檢驗(yàn)處理所得的 GC-MS 數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)改變 HE染色顯示:正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝索排列規(guī)則有序，肝細(xì)胞大小、形態(tài)一致，細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，核仁明顯;模型組大鼠肝組織中有大量脂肪空泡形成，部分空泡細(xì)胞融合，形成較大的囊泡結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞索排列紊亂，纖維結(jié)締組織大量增生，有明顯的假小葉形成;疏肝健脾方組干預(yù)后 12周后，脂肪變性、纖維組織增生明顯減少，假小葉形成得到改善，肝纖維化呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)，結(jié)果如圖1所示。

圖 1 疏肝健脾方對(duì) 12 周模型大鼠肝組織病理性改變的影響 （HE×200）Fig.1 Effects of Shugan Jianpi Formula on liver histological exam ination of hepatic fibrosis rats（HE×200）

3.2 各組大鼠血清 GC-TOF/MS 總離子圖 基于LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫(kù)，總共得到 519 種代謝化合物， 再通過(guò) Chroma TOF4.3X軟件對(duì)數(shù)據(jù)校正后補(bǔ)齊空白值，消除數(shù)據(jù)噪音，然后用內(nèi)標(biāo)歸一，最終得到447 種代謝化合物。 為了進(jìn)一步說(shuō)明代謝譜的不同，對(duì)代謝譜進(jìn)行預(yù)處理并運(yùn)用模式識(shí)別技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示。

3.3 各組大鼠尿液樣本主成分分析 （PCA） PCA是對(duì)高緯數(shù)據(jù)降維的方法， 是將分散在一組變量的信息集中到二、三個(gè)綜合指標(biāo) （主要成分）上，從而利用主要成分提取數(shù)據(jù)集的特征，是對(duì)原始數(shù)據(jù)的真實(shí)再現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于各種因素的干擾，正常組、模型組、疏肝健脾方組基本未分開(kāi)，各組內(nèi)樣本間差異較大，且正常組、疏肝健脾方組各有一點(diǎn)與其它組具有明顯差異。結(jié)果如圖3所示。

圖 2 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組大鼠尿液樣品 12周總離子圖Fig.2 Typical total GC/TOFMS TIC chrom atogram s of rat urine sam p les obtained for all three groups at 12-week

圖3 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組大鼠尿液樣品12 周 PCA得分圖Fig.3 The PCA score plot of rat urine sam ples obtained for the three groups at 12-week

3.4 各組大鼠尿液樣本偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 由于 PCA圖并未能完全分離， 因此，為了獲取更加理想的組間分離及增強(qiáng)對(duì)分類貢獻(xiàn)大的變量的識(shí)別， 進(jìn)行了 有監(jiān)督 的 PLS-DA分析。PLS-DA主要是先拿對(duì)組間區(qū)分性大的部分?jǐn)?shù)據(jù)建立類別間的數(shù)學(xué)模型，然后再拿剩余的部分?jǐn)?shù)值去比對(duì)，得出一些評(píng)判數(shù)值如監(jiān)督模型的解釋率（R2Y）、模型的預(yù)測(cè)能力 （Q2）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)行 PLS-DA分析后， 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組完全被分開(kāi)， R2Y=0.832， Q2=0.274， 可見(jiàn)該模型穩(wěn)定性、擬合能力及預(yù)測(cè)能力均較好。在此之后， 通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次 （n=200）改變分類變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。 通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)獲得的 R2= 0.476， Q2=-0.178， Q2 負(fù)值表明該模型是可靠的，模型未存在過(guò)擬合現(xiàn)象。結(jié)果如圖4所示。

圖 4 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組大鼠尿液樣品 12 周的 PLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)Fig.4 The PLS-DA score and cross-validation of rat u rine sam p les obtained for the th ree groups at 12-week

3.5 各組大鼠尿液樣本正交偏最小二乘法判別式分析 （OPLS-DA） 正交信號(hào)校正技術(shù) （ OSC）可以濾掉與類別判斷正交 （不相關(guān)）的變量信息，只保留與類別判斷有關(guān)的變量，從而使類別判別分析能集中在這些與類別的判別相關(guān)的變量上，提高了判別的準(zhǔn)確性［6］。 通過(guò)對(duì) OPLS-DA模型進(jìn)行正交矯正處理，構(gòu)建了 OPLS-DA圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)行 OPLS-DA分析后， 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組完全可被分開(kāi)，提示造模后大鼠尿液的內(nèi)源性代謝物與正常對(duì)照組有明顯變化，疏肝健脾方干預(yù)12周后可影響肝纖維化大鼠的體內(nèi)代謝。 結(jié)果如圖5所示。

圖5 正常組、 模型組、 疏肝健脾方組大鼠尿液樣品12 周的 OPLS得分圖Fig.5 OPLS-DA score of rat urine samples obtained for the three groups at 12-week

3.6 各組大鼠生物標(biāo)志物的篩選及鑒定 為了使分析更深一步， 通過(guò)將 VIP（變量重要性投影值）＞1 及 P＜0.05 的化合物篩選出來(lái)作為差異性化合物。根據(jù)變量對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，得到其質(zhì)譜圖，利用 LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)具有明顯差異的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 基于以上分析， 2-羥基丁酸、 異亮氨酸、 beta-丙氨酸、丙二酸、 胞嘧啶、 賴氨酸 6個(gè)內(nèi)源性代謝物被篩選出來(lái)作為具有明顯差異的化合物。 與正常組相比， 模型組 2-羥基丁酸、 異亮氨酸、 beta-丙氨酸、 氨基丙二酸、 胞嘧啶、 賴氨酸水平顯著升高;給予疏肝健脾方干預(yù)后，與模型組相比， beta-丙氨酸、 氨基丙二酸、 胞嘧啶、 賴氨酸水平顯著下降， 2-羥基丁酸、 異亮氨酸雖有所下降，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組相比，上述6種物質(zhì)水平雖均有所上升，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示疏肝健脾方有使紊亂的代謝譜向正?；貧w的趨勢(shì)。結(jié)果如表1所示。

表1 各組大鼠生物標(biāo)志物及其變化趨勢(shì)Tab.1 Identifieation results of the 6 differentialm etabolites and changed tendency of rat urine sam p les at 12-week

4 討論

代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，定性定量研究生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，分析生物體在不同狀態(tài)下的代謝指紋圖譜的差異，獲得相應(yīng)的生物標(biāo)志物群，從而揭示生物體在特定時(shí)間、環(huán)境下的整體功能狀態(tài)的科學(xué)［7-8］。

肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的中樞器官，具有特有的功能和某些酶系，體內(nèi)多種激素、氨基酸、糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等代謝都是在肝臟中進(jìn)行的［9］。 因此，從代謝組學(xué)的角度，對(duì)肝臟和肝臟疾病進(jìn)行系統(tǒng)研究尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)采用 GC-TOF/MS 技術(shù)， 從代謝組學(xué)的角度，研究疏肝健脾方防治大鼠化學(xué)性肝纖維化的作用機(jī)制研究。結(jié)果表明，疏肝健脾方可改善肝纖維化大鼠病理組織學(xué)損傷程度，且有使紊亂的代謝譜向正常回歸的趨勢(shì)。這些明顯變化的代謝物可部分解釋疏肝健脾方的作用機(jī)制。

2-羥基丁酸是由 alpha-丁酮酸衍生而成的一種有機(jī)酸， 與谷胱甘肽合成代謝與能量代謝有關(guān)［10］。谷胱甘肽能夠保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激損傷，與肝臟疾病關(guān)系密切［11］。 模型組大鼠尿液中 2-羥基丁酸水平顯著升高，表明模型組存在谷胱甘肽與能量代謝異常; 給予疏肝健脾方干預(yù)后， 可下調(diào) 2-羥基丁酸水平，提示其可改善肝纖維化大鼠紊亂的谷胱甘肽合成與能量代謝。

異亮氨酸為支鏈氨基酸，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)合成肝葡萄糖的生糖型氨基酸。異亮氨酸經(jīng)氨基轉(zhuǎn)移及脫羧反應(yīng)生成的 α-甲基丁酰輔酶 A， 進(jìn)行類似脂肪酸的分解后，生成乙酰輔酶A與丙酰輔酶A，后者成為琥珀酰輔酶A，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。模型組大鼠尿液中異亮氨酸水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］。 經(jīng)疏肝健脾方干預(yù)后， 可使升高的異亮氨酸水平明顯得到下調(diào)，推測(cè)是由于三羧酸循環(huán)恢復(fù)到正常，為了彌補(bǔ)模型形成期能量的缺乏而消耗了更多中間產(chǎn)物。

有文獻(xiàn)報(bào)道，丙二酸、胞嘧啶均參與嘧啶的合成代謝［13］。 嘧啶的合成代謝包括氧化分解和從頭合成兩條途徑，主要在肝臟中進(jìn)行。首先，通過(guò)核苷酸酶及核苷酸磷酸化酶的作用，分別除去核糖和磷酸生成嘧啶堿， 再進(jìn)一步分解生成 β-丙氨酸等。β-丙氨酸是輔酶 A的組分， 輔酶 A為體內(nèi)乙?；磻?yīng)的輔酶，對(duì)糖、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝起重要作用。與正常組相比， 模型組丙二酸、 胞嘧啶、 β-丙氨酸水平顯著上升， 與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］; 與模型組相比， 疏肝健脾方干預(yù) 12 周后， 可下調(diào) β-丙氨酸、胞嘧啶的水平，提示其對(duì)紊亂的糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝具有調(diào)節(jié)作用。

肝臟是物質(zhì)代謝的樞紐，也是氨基酸代謝的中心器官。 皮下注射 CCl4后， 可產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用，導(dǎo)致溶酶體酶大量釋放入血，組織蛋白分解加強(qiáng)，部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，使肝細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能降低，肝對(duì)氨基酸清除率降低，造成氨基酸水平明顯升高［15］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 模型組賴氨酸水平顯著升高，給予疏肝健脾方干預(yù)后，可下調(diào)賴氨酸水平。

綜上所述，疏肝健脾方對(duì)肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)能量代謝、嘧啶合成代謝、氨基酸代謝有關(guān)。

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Effects of Shugan Jianpi Formula on urine metabonom ic in rats w ith hepatic fibrosis induced by CC l4

JIANG Hui1， WU Fu-rong2， GAO Jia-rong1*， CHEN Jin-feng1

（1.The First Affiliated Hospital of Anhui University of ChineseMedicine， Crade3 Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation， State Administration of TCM， Hefei 230031， China;2.Department of Pharmacy， Anhui Provincial Hospital， Hefei230001， China）

AIM To study themetabolic changes of Shugan Jianpi Formula（Artemisiae scopariae Herba， BupleuriRadix， AstragaliRadix， Paeoniae Radix alba， Aurantii Fructus， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， Polyporus， Poria， Lycopi Herba ） on experimental liver fibrosis in rats and to explore its possible mechanisms. METHODS The rats with liver fibrosiswere induced by subcutaneous injection of50%carbon tetrachloride-olive oil solution.They were assigned to themodelgroup and Shugan Jianpi Formula group.Some other ratswere selected as health control group.All groupswere given lavage for twelve weeks.Themetabolic profile changes of urine samples were analyzed by GC/TOFMS and the resultswere processed by principal component analysis， partial least squares-discriminate analysis， and orthogonal projections to latent structures discriminant analysis.RESULTS Compared with the control group，six significantly changed metabolites， such as 2-hydroxybutanoic acid， isoleucine，beta-alanine acid， cytidine， lysine were identified.As compared with themodel group，Shugan Jianpi Formula group could reverse the levels of thesemetabolites to normal or close to normal levels.CONCLUSION The current study indicates that Shugan Jianpi Formula has significant anti-fibrotic effects on CCl4-induced liver fibrosis in rats， whichmightbe related to regulating the dysfunction of energymetabolism，pyrimidinemetabolism and amino acid metabolism.

Shugan Jianpi Foumula;hepatic fibrosis;metabonomics;GC-TOF/MS

R969.1

:A

1001-1528（2014）12-2457-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.003

2014-05-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81102874）

姜 輝 （1980—） ， 男， 碩士， 主管藥師， 研究方向: 肝纖維化的中醫(yī)藥防治。 Tel: （0551） 62838553， E-mail:jhanbing@ 163.com

*通信作者: 高家榮 （1964—） ， 男， 碩士， 主任藥師， 研究方向: 中藥制劑開(kāi)發(fā)。 Tel: （0551） 62838556， E-mail:zyfygjr@163.com