智康康, 楊中鐸, 舒宗美

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 甘肅 蘭州 730050）

[成分分析]

藏藥薩折抗單胺氧化酶活性成分研究

智康康, 楊中鐸*, 舒宗美

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 甘肅 蘭州 730050）

目的 分離鑒定藏藥薩折中的單胺氧化酶抑制劑。 方法 運(yùn)用硅膠、 聚酰胺、 凝膠柱色譜和 HPLC分離純化薩折的化學(xué)成分， 并根據(jù)其理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。 采用 Holt法進(jìn)行抗單胺氧化酶活性測(cè)定。 結(jié)果 從薩折的乙醇提取物 中 分離得到 3 個(gè)化 合 物， 分別 鑒 定為沒食子 酸 （1）， 沒食子酸 甲 酯 （ 2）， 3，4，8，9，10-pentahydroxydibenzo［ b，d］ pyran-6-one（3 ） 3 個(gè)化 合 物。 其對(duì) 單 胺 氧 化酶 的 半 數(shù) 抑 制 濃 度 （ IC50） 分 別 為 10.0、 35.9、35.2 μmol/L。 結(jié)論 化合物 3 為首次從薩折中分離得到， 化合物 1 ～3 均具有較強(qiáng)單胺氧化酶抑制活性， 其中化合物1 活性最好， 其 IC50為 10.0 μmol/L。

薩折;化學(xué)成分;單胺氧化酶抑制劑

薩折為一種常用藏藥，在我國(guó)藏區(qū)主要用于腎臟病和三災(zāi)病的治療，其基源植物為海南蒲桃Syzygium cumini（ Linn.） Skeels的果實(shí)。 該植物性向陽(yáng)，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，適生性強(qiáng)，分布較廣，產(chǎn)于云南、福建、廣東、廣西;生于低海拔疏林中或曠野［1］。 單胺氧化酶是一種存在于線粒體外膜的氧化還原酶，通過催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝，使其失去生理活性，而控制機(jī)體內(nèi)胺類物質(zhì)的水平［2］。 目前研究表明單胺氧化酶抑制劑是治療和改 善抑郁 癥以及帕金 森 病 的有效藥物［3］。本實(shí)驗(yàn)采用 Holt法［4］在對(duì)藏藥總有機(jī)酸提取物抗單胺氧化酶活性篩選的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)薩折提取物具有顯著的單胺氧化酶 （MAO） 抑制活性， 其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度 （ IC50） 為 6.06 μg/mL。 本研究對(duì)其中的 MAO抑制劑進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為薩折的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

Bruker-400 型核磁共振波譜儀 （ 德國(guó) Bruker公司，1H-NMR 400 MHz，13C-NMR 125 MHz）;LC-2000 型半制備高效液相色譜工作站 （日本分光株式會(huì)社）， Polaris C18色譜柱 （ 4.6 mm×250 mm），微量進(jìn)樣器; 硅膠 （200 ～300 目， 青島海洋化工廠），sephadex LH-20 （ Pharmacia公 司），聚 酰 胺（100 ～200 目， 路橋四甲生化塑料廠）; 薄層層析硅膠 （ GF254， 青島海洋化工廠）;HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）; RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）。所有溶劑為分析純。

薩折藥材購(gòu)自西寧八一藥材市場(chǎng)，經(jīng)蘭州理工大學(xué)楊林副教授鑒定為海南蒲桃 Syzygium cumini（Linn.） Skeels的果實(shí)。

氯吉林購(gòu)自 Sigma公司。 酪胺、 帕吉林鹽酸鹽、磷酸異丙煙肼、 香草酸、 辣根過氧化酶 （Ⅱ型）、 4-氨基安替吡啉等購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

2 方法

2.1 提取與分離 將干薩折 （5 kg） 粉碎， 用95%的工業(yè)乙醇提取， 回流提取 2 次， 每次 2 h，抽濾，減壓濃縮至浸膏，回收乙醇，再將浸膏懸浮于 5 L蒸餾水中， 用 4 mol/L NaOH調(diào)懸浮水溶液至 pH為 10 ～11， 靜置過夜; 抽濾; 再用 2 mol/L HCl溶液調(diào) pH為 2 ～3， 用乙酸乙酯等體積萃取，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得薩折總有機(jī)酸。

將薩折總有機(jī)酸進(jìn)行聚酰胺 （100 ～200 目）柱色 譜 分 離， 依 次 以 水 和 30%、 50%、 70%、90%甲醇梯度洗脫， 棄去水洗脫部分， 30% ～90%甲醇洗脫部分，TLC跟蹤合并，得到 6 個(gè)部分（Fr.1 ～Fr.6）。 測(cè)定 Fr.1 ～Fr.6 的單胺氧化酶抑制活性， 發(fā)現(xiàn)組分 Fr.1 以及 Fr.3 具有顯著活性，其 IC50分別為 0.3、 11.3 mg/L。 Fr.1 經(jīng)硅膠柱色譜， 三氯甲烷-甲醇 （20 ∶1 ～1 ∶1） 分離得到 Fr. 1a～Fr.1c;Fr.1c經(jīng)過 LH-20 柱色譜甲醇洗脫純化， 得到化合物 1 （120 mg）。 Fr.3 經(jīng)聚酰胺柱色譜， 丙酮-甲 醇 （40 ∶1 ～1 ∶1） 梯 度 洗 脫 得 到Fr.3a～Fr.3e，分別對(duì) Fr.3a與 Fr.3c進(jìn)行 HPLC分離， 甲醇-水 （30 ∶70 ～80 ∶20，含有 0.1%三氟乙酸） 洗脫， 最后用 LH-20 柱色譜， 甲醇洗脫純化，得到化合物 2 （10 mg）， 化合物 3 （150 mg）。

2.2 單胺氧化酶抑制活性的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的 Holt方法評(píng)價(jià)單胺氧化酶抑制活性， 其中磷酸異丙煙肼作為陽(yáng)性藥，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

反應(yīng)孔: 在 96 孔酶標(biāo)板孔中加入 40 μL酶溶液 （每 1 mL含有 0.5 mg蛋白質(zhì)，由 Bradford［5］法測(cè)定），40 μL待測(cè)樣品， 混勻后在 37 ℃培養(yǎng)20 min， 取出后再加入 120 μL酪胺 （5 mmol/L），40 μL顯色劑 （1 mmol/L香草酸， 0.5 mmol/L 4-氨基安替吡啉和4 U/mL辣根過氧化酶的混合液），在 37 ℃培養(yǎng) 1 h， 在 490 nm讀取吸光值 （以上均用 0.2 mol/L， pH7.6 磷酸緩沖液配制）。 空白孔:用 40 μL緩沖液代替待測(cè)樣品， 其他不變。 空白陰性孔: 用120 μL緩沖液代替底物酪胺， 其他不變。樣品對(duì)照孔: 用 120 μL緩沖液代替底物酪胺， 其他不變。由以上則可計(jì)算出抑制率，公式:

其中化合物1、 2、 3 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的摸索， 最終測(cè)定 IC50值時(shí)選擇 6 個(gè)質(zhì) 量濃度， 化合物 1 為 40、30、 25、20、 15、 10 μg/L， 化合物 2 為 140、 120、100、 80、 60、 40 μg/L， 化合物 3 為 100、 80、 60、50、 40、 20 μg/L。 IC50值通過 Grafit5 計(jì)算獲得。

為了測(cè)定 MAO-A的抑制活性， 需要在酶液中加入對(duì)應(yīng)體積的 500 nmol/L的帕吉林溶液 （選擇性單胺氧化酶-B抑制劑）預(yù)孵 30 min， 去完全抑制單胺氧化酶-B， 再進(jìn)行測(cè)定。 反之， 亦然 （氯吉靈為選擇性單胺氧化酶 -A抑制劑）。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1: 白色針狀結(jié)晶 （甲醇）， 與沒食子酸對(duì)照品進(jìn)行薄層色譜對(duì)比試驗(yàn)， Rf值一致， 混合熔點(diǎn) 不 下 降。1H-NMR （ CD3OD， 400 MHz） δH: 7.07 （2H， s， H-2， H-6 ）， 其 氫 譜 數(shù) 據(jù) 與 文 獻(xiàn)［6］ 一致，故鑒定為沒食子酸。

化合物 2: 無色顆粒狀結(jié)晶 （甲醇），1H-NMR（CD3OD， 400MHz） δH:7.03 （2H， s，H-2，6），3.80 （3H， s， OCH3 ）。13C-NMR （ CD3OD，125 MHz） δC:169.0 （C-7） ， 146.5 （C-3， 5）， 139.7（ C-4 ）， 121.4 （ C-1 ）， 110.1 （ C-2， 6 ）， 52.2（C-8）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［7］ 一致， 故鑒定為沒食子酸甲酯。

化合 物 3: 黃 綠 色 粉 末，1H-NMR （ CD3OD，400 MHz） δH:8.44 （1H， d， J=9.2 Hz， H-1），7.37 （1H， s， H-7 ） ， 6.76 （ 1H， d， J=9.2Hz，H-2 ）。13C-NMR （ CD3OD， 125 MHz） δC:163.9（C-6）， 146.8 （C-3）， 146.5 （C-8）， 144.1 （C-10）， 142.4 （ C-9 ），141.0 （C-4a），133.3 （ C-4）， 119.1 （ C-1 ）， 118.5 （ C-10a） ， 112.9 （ C-10b）， 112.4 （ C-2 ）， 111.7 （ C-6a）， 108.1 （ C-7）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［8］ 一致， 故鑒定為 3，4，8，9，10-pentahydroxydibenzo［b，d］ pyran-6-one。

3.2 化合物的單胺氧化酶抑制活性 結(jié)果表明化合物 1、 2、 3 均具有 MAO抑制活性 （見表 1）， 且均具有較強(qiáng)的總 MAO抑制活性， 但對(duì) MAO-A和MAO-B均無明顯選擇性。 其中化合物 1 的 MAO-B的 IC50值 5.9 μmol/L小于陽(yáng)性藥的 9 μmol/L。

表 1 化合物1 ～3 抑制單胺氧化酶的活性Tab.1 Inhibitory activities of com pounds 1-3

4 討論

已有對(duì)薩折的研究主要在以下幾個(gè)方面:其化學(xué)成分的研究集中在花青素，果色素，黃酮與木脂素葡糖苷方面［9-12］; 其提取物對(duì)細(xì)胞砷中毒有明顯的緩解作用，可考慮將其用于治療砷中毒相關(guān)疾?。?3］; 其原花青素具有較強(qiáng)的清除自由基與抗氧化活性等 體 外活 性［14-15］; 其 種子 提 取 物具 有 促 進(jìn)胰島細(xì)胞生成和胰島素分泌的作用［16-18］。 此前尚未見有報(bào)道過其具有抗單胺氧化酶活性，本研究發(fā)現(xiàn)薩折提取物具有顯著的抗單胺氧化酶活性。

沒食子酸是多種中藥中的活性成分，具有抗炎、 抗突變、 抗氧化以及抗腫瘤等生物學(xué)效應(yīng)［19］，但到目前為止未見沒食子酸抗單胺氧化酶活性的報(bào)道。 本研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸類化合物 1、 2均具有顯著抗單胺氧化酶活性。化合物2由于比1結(jié)構(gòu)中多一個(gè)甲氧基，活性大幅下降，這說明沒食子酸的羧基被酯化后，活性會(huì)下降。

化合物3屬于鞣花酸類化合物，此類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌及增強(qiáng)免疫作用等多種生物活性［20-22］， 但到目前為止， 未見這類化合物抗單胺氧化酶活性的報(bào)道。其作為先導(dǎo)物，經(jīng)過修飾改造后，有望能得到抗單胺氧化酶活性高的化合物。

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M onoam ine oxidase inhibitors from Syzygium cum ini（Linn.） Skeels

ZHIKang-kang， YANG Zhong-duo*， SHU Zong-mei
（ School of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou 730050， China）

AIM To studymonoamine oxidase inhibitors from Syzygium cumini（ Linn.） Skeels.METHODS The compounds were isolated and purified by various column chromatographic techniques and their structures were elucidated on the basis of spectral analysis（ EI-MS，1H-NMR，13C-NMR）.RESULTS Three compounds were isolated and identified as gallic acid （1） ， methyl gallate（2 ） and 3 ，4，8，9 ，10-pentahydroxydibenzo［ b，d］pyran-6-one（3）.CONCLUSION Compound 3 is obtained from this plant for the first time.Compound 1 shows significant inhibitory activities against themonoamine oxidase with IC50values of10.0 μmol/L.

Syzygium cumini（ Linn.） Skeels;chemical constituents;monoamine oxidase inhibitor

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2547-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.022

2013-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （21262022）; 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （LY12B02005）; 蘭州理工大學(xué)紅柳杰出人才資助項(xiàng)目 （J201303）

智康康 （1989—）， 男， 碩士生， 從事天然藥物化學(xué)方面的研究。 Tel:15294227531， E-mail:sqyjktwzkk@163.com

*通信作者: 楊中鐸 （1976 —） ， 男， 教授， 博士， 從事 天然 藥物 化學(xué)方 面的 研究。 Tel: （ 0931 ） 2976703， E-mail:yangzhongduo@ 126.com