程 濤，鐘其頂 *，王道兵，武竹英，李國輝，王 敏

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.全國食品發(fā)酵工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100015）

白蘭地生產(chǎn)在我國歷史悠久，然而直至中國第一個民族葡萄酒企業(yè)—張?jiān)Ｆ咸厌劸乒境闪⒑?，國?nèi)白蘭地才真正得以發(fā)展。改革開放以后，我國的白蘭地工業(yè)和國外交流頻繁，較好的實(shí)現(xiàn)了與國際接軌，特別是近幾年來，隨著人們生活水平的提高，白蘭地逐漸被人們所喜愛[1-2]。目前，國產(chǎn)白蘭地的年產(chǎn)量為2 000萬L左右，大量白蘭地產(chǎn)品需從國外進(jìn)口，其中僅干邑白蘭地的銷售總量就超過了2 700萬L（2012年數(shù)據(jù)），天然白蘭地的工藝復(fù)雜，釀造成本較高，因而價格也較高，也正因?yàn)榇?，國?nèi)白蘭地市場比較混亂。據(jù)調(diào)查，市場的假洋白蘭地的比例不斷上升，另有一些不法商家為節(jié)約成本，摻入廉價的糖與果汁進(jìn)行發(fā)酵，或者直接采用食用酒精進(jìn)行勾兌以冒充天然白蘭地。

根據(jù)GB/T 17204—2008《飲料酒分類》的定義，白蘭地是以新鮮水果或果汁為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、調(diào)配而成的蒸餾酒。但諸如摻入廉價糖或果汁進(jìn)行發(fā)酵，或以食用酒精等食品添加劑進(jìn)行生產(chǎn)的假冒偽劣產(chǎn)品，其理化指標(biāo)可能與正規(guī)的白蘭地產(chǎn)品相近或相同，因此當(dāng)前廣泛使用的理化分析法難以對其進(jìn)行區(qū)分和辨別[3-5]。

穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻假鑒別中具有重要作用，現(xiàn)在已成功用于果汁摻水[6-7]、摻糖分析[8-9]、蜂蜜摻糖[10-11]、谷物和水果酒精的質(zhì)量評價[12-14]及植物學(xué)來源[15-19]等多個方面。ROBMANN A等[20]分別應(yīng)用該技術(shù)甄別葡萄酒、龍舌蘭酒和白蘭地[21]真假，鐘其頂?shù)萚22]研究了穩(wěn)定碳同位素技術(shù)在固態(tài)法白酒和固液法白酒鑒別中的應(yīng)用，效果良好。然而，國內(nèi)還未有白蘭地領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用，尤其缺乏穩(wěn)定同位素分布特征及影響因素的研究。本研究以梨白蘭地為研究對象，調(diào)查了其乙醇碳同位素分布特征，分析了其主要的影響因素，探討了應(yīng)用氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀（gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry，GC-C-IRMS）辨別白蘭地產(chǎn)品真假的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梨汁樣品：選取新鮮、飽滿、無病斑、無劃痕的果實(shí)，去除果梗、果核和果皮，切成瓣?duì)罘湃霐嚢铏C(jī)中攪拌5 min，2 000 r/min 離心10 min取上清液，冷藏待用；梨果：2013年4月至2014年9月購自北京某農(nóng)貿(mào)市場和家樂福超市；梨原白蘭地：北京某梨白蘭地廠；安琪活性干酵母；去離子水；氫氧化鈣粉末；0.1 mol/L硫酸溶液；氦氣（純度≥99.999%）；丙酮（色譜純）：韓國DUKSAN Pure Chemicals有限公司。除特殊注明外，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta V advantage 氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀（配Triplus自動進(jìn)樣器）、安捷倫DB-Wax毛細(xì)管色譜柱（50 m×0.32 mm×0.20 μm）；FLASH 2000元素分析-同位素比值質(zhì)譜儀（element analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）：美國Thermo fisher公司；3K15離心機(jī)：美國Sigma公司；LGJ-JA-80冷凍干燥機(jī)：北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；ZH7924電熱恒溫水浴箱：北京中慧天城科技有限公司；HDM-1000磁力攪拌器：北京世紀(jì)華科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XS205U十萬分之一天平：瑞士Mettler-Toedo公司；LRH系列恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；1500夏朗德壺式蒸餾器：新鄉(xiāng)市圣達(dá)輕工機(jī)械有限公司；JE25C11榨汁機(jī)：美的集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 糖的分離提取

取40 mL果汁于50 mL離心管中，在相對離心力（relative centrifugal force，RCF）1 400×g條件下離心10 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL小燒杯中，加入1.6 g氫氧化鈣粉末，攪拌均勻后于90 ℃水浴中靜置3 min；將上述熱溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在RCF為1 400×g條件下離心3 min，棄去沉淀，取上清液，用0.1 mol/L的硫酸調(diào)整其pH 值為5.0左右；將上述酸化后的上清液置于4 ℃冰箱靜置約15 h，去除沉淀，將溶液冷凍干燥并均質(zhì)成粉末。

1.3.2 發(fā)酵處理

取果汁100 g，高壓蒸汽滅菌后加入1.0 g安琪釀酒活性干酵母，無氧條件下在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵至質(zhì)量恒定。

1.3.3 乙醇的處理

乙醇經(jīng)過丙酮稀釋后由自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)入燃燒管充分燃燒成CO2，再由載氣帶入IRMS中測定其δ13C值。

1.3.4 測定條件

GC-C-IRMS色譜程序：載氣為氦氣；柱流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持5 min，以1 ℃/min 升溫至50 ℃后保持1 min后以15 ℃/min 升溫至200 ℃并保持2 min；進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1。

EA-IRMS工作條件：氧化管溫度980 ℃，還原管溫度680 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min[25]。

1.3.5 糖的測定

稱取約0.1 mg粉末于錫杯中，包好后待測，每個樣品平行測定2次，得出樣品的δ13C值。

1.3.6 乙醇的測定

發(fā)酵液經(jīng)丙酮稀釋后直接進(jìn)樣測定，每個樣品測定兩次。

1.3.7 結(jié)果表示

實(shí)際工作中采用相對測量法，將待測樣品的碳同位素比值與碳同位素國際標(biāo)準(zhǔn)美國南卡羅來納州白堊紀(jì)皮狄組層位中的擬箭石化石（peedee belemnite，PDB）同位素比值比較，以千分差（‰）的形式表示樣品的同位素組成，記作δ13C。δ13C的計(jì)算公式如下：

Rsample和Rstandard分別表示樣品和國際標(biāo)準(zhǔn)品的同位素（13C/12C）比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇δ13C值分布特征

選取北京、新疆、河北等地區(qū)的梨，榨汁后發(fā)酵，GCC-IRMS測定乙醇δ13C值，結(jié)果見表1所示。

表1 不同地區(qū)水果發(fā)酵后乙醇δ13C值Table 1 Ethanol δ13C of fruit in different regions after fermentation

表1數(shù)據(jù)表明，梨汁發(fā)酵乙醇的δ13C值分布范圍為-29‰～-27‰，符合C3植物發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇的碳同位素特征；但是，盡管同是梨汁發(fā)酵，同一產(chǎn)地不同品種的梨汁發(fā)酵乙醇δ13C值很接近，而不同產(chǎn)地的梨汁乙醇δ13C值差異卻比較大。為研究該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，測定了各梨汁的總糖中δ13C，以梨汁總糖的δ13C值（x）為橫坐標(biāo)，發(fā)酵后乙醇的δ13C值（y）為縱坐標(biāo)，繪制其相關(guān)性曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 酵前總糖和乙醇的δ13C值之間的相關(guān)性Fig.1 Correlation of δ13C values between sugar content and ethanol before fermentation

由圖1可知，盡管總糖與乙醇的δ13C值之間存在一定差異（-29.01‰～-25.31‰），但二者相關(guān)性良好（R2=0.98），這與ROBMANN A等從葡萄汁與葡萄汁發(fā)酵液中得到的結(jié)果一致；雖然決定植物有機(jī)物δ13C值分布特征的是植物的光合作用類型[27]，但同種植物，由于各自生長環(huán)境中的溫度、濕度、光照條件、大氣壓力、鹽分和營養(yǎng)元素含量的差異，均會影響植物穩(wěn)定同位素的分餾過程乃至植物穩(wěn)定同位素組成，而發(fā)酵過程中糖的同位素組成差異則顯現(xiàn)在其代謝產(chǎn)物乙醇中。

2.2 白蘭地蒸餾過程的影響

自然界存在著廣泛的穩(wěn)定同位素分餾作用，若轉(zhuǎn)化/收集不完全，由于不同穩(wěn)定同位素構(gòu)成的分子的質(zhì)量差異，穩(wěn)定同位素含量易出現(xiàn)變化。白蘭地是一種高雅香醇的飲料酒，它的芳香物質(zhì)主要是通過蒸餾獲得的，為研究該工序?qū)σ掖鸡?3C值的影響，在蒸酒過程進(jìn)行跟蹤取樣，測定餾分中乙醇的含量和δ13C值，結(jié)果見圖2。

圖2 精餾過程中乙醇含量和δ13C變化Fig.2 Change of δ13C values and ethanol content during rectification

由圖2可知，蒸酒過程中，隨著餾分中乙醇含量不斷降低，乙醇δ13C值也呈現(xiàn)不斷變小的趨勢，第一次與最后一次取樣的乙醇δ13C值差異達(dá)1.5‰，但對于可陳釀部分（50%vol～80%vol），乙醇的δ13C值平均為-28.48‰，與發(fā)酵醪中乙醇的（δ13C=-28.51‰）十分接近，因此可以斷定，盡管白蘭地生產(chǎn)時需用水對陳釀酒進(jìn)行稀釋（至40%vol左右），但由于無外源乙醇的混入，天然白蘭地的乙醇δ13C值不再變化。

2.3 添加玉米酒精對白蘭地中乙醇δ13C的影響

以玉米酒精和蒸餾水為基礎(chǔ)配制與梨白蘭地濃度相同的乙醇水溶液，分別按比例5%、15%、30%、50%向梨白蘭地中加入上述乙醇水溶液，混合均勻后測定乙醇δ13C值，結(jié)果見圖3。

圖3 外源酒精添加比率與白蘭地中乙醇δ13C值(‰)的關(guān)系Fig.3 Linear relation between exogenous ethanol addition and δ13C values of brandy alcohol

由圖3可知，添加玉米酒精后，乙醇δ13C值出現(xiàn)明顯變化，且隨著玉米酒精比例的增加而逐漸偏正（R2=0.99）。表1結(jié)果表明，梨汁發(fā)酵乙醇δ13C值的自然波動范圍為-29‰～-27‰，當(dāng)混入15%玉米酒精時樣品乙醇δ13C值則已超出95%的置信區(qū)間。

2.4 發(fā)酵前加入蔗糖對乙醇δ13C的影響

選擇北京地區(qū)的梨汁為研究對象，根據(jù)其糖濃度向梨汁中加入10%、30%、50%、70%、80%、90%甘蔗糖溶液，發(fā)酵后測定發(fā)酵液的乙醇δ13C值，結(jié)果見圖4。

圖4 外源蔗糖添加比率與白蘭地中乙醇δ13C的關(guān)系Fig.4 Linear relation between exogenous sucrose addition and δ13C values of brandy alcohol

由圖4可知，發(fā)酵液乙醇δ13C與甘蔗糖含量呈良好的線性正相關(guān)關(guān)系（R2=0.98），這是由于梨為C3植物，而甘蔗為C4植物，二者的糖中δ13C值明顯不同，因此，可利用乙醇δ13C值檢測來判斷發(fā)酵原料的真實(shí)屬性。因此乙醇δ13C值可作為白蘭地產(chǎn)品中酒精來源或發(fā)酵原料溯源的有效指示劑。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了梨汁的糖和發(fā)酵液乙醇中δ13C值特征，梨汁的糖和乙醇明顯表現(xiàn)出C3植物的碳同位素分布特征，并且乙醇與糖的δ13C值具有良好的線性關(guān)系。而作為白蘭地生產(chǎn)特殊組成部分的蒸酒工藝，雖然出現(xiàn)了乙醇碳同位素分餾，但陳釀部分與發(fā)酵醪相比具有相同的乙醇δ13C值特征，因此乙醇δ13C值可作為白蘭地產(chǎn)品中酒精來源或發(fā)酵原料溯源的有效指示劑。模擬實(shí)驗(yàn)表明，利用乙醇δ13C值可檢測出15%的玉米酒精，也能幫助判斷白蘭地的發(fā)酵原料中是否混入C4植物成分。本研究為酒類食品真實(shí)性的鑒別提供一個新的手段，適合推廣應(yīng)用，同時也為進(jìn)一步規(guī)范我國飲料酒生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。需要說明的是，本研究僅調(diào)查分析了部分地區(qū)的梨的特征，由于植物糖分中碳同位素分布受眾多因素影響，選擇乙醇δ13C值作為客觀指標(biāo)檢測各白蘭地產(chǎn)品中的玉米酒精或檢測生產(chǎn)原料中的C4植物糖（漿），還需詳盡的數(shù)據(jù)作為應(yīng)用的基礎(chǔ)。

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