康三江，張永茂，曾朝珍，張海燕，張霽紅，張 芳

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果白蘭地是以蘋果汁為原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵并蒸餾后得到的一種新型水果類白酒[1]。蘋果白蘭地的揮發(fā)性香氣物質(zhì)是構(gòu)成其質(zhì)量的重要因素，也是評(píng)價(jià)其內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣的好壞直接影響著蘋果白蘭地的風(fēng)味品質(zhì)和消費(fèi)者的選購(gòu)心理[2]。ZHAO Y P等[3]對(duì)白蘭地中的芳香物質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在鑒定出來(lái)的109 種化合物中，最主要的呈香物質(zhì)是酯類物質(zhì)，其中2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、β-大馬酮、反式-β-甲基-γ-辛內(nèi)酯是最重要的呈香化合物。彭松[4]通過(guò)對(duì)紅棗白蘭地樣品的分析得出，其揮發(fā)性物質(zhì)主要為酯類、醇類、醛類、呋喃類、芳香族類、縮醛類和萜烯類。盧柯等[5]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成荔枝白蘭地香氣特征的物質(zhì)主要是酯類、醇類、酸類、少量的酚類及萜烯類化合物。

氮源是酵母生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，蘋果汁中含有足夠酵母生長(zhǎng)所必需的碳水化合物，但其氮的含量較低[6]，氯化銨為酵母發(fā)酵所需的優(yōu)質(zhì)無(wú)機(jī)氮源物質(zhì)之一。在發(fā)酵中添加適宜的氮源將會(huì)有利于酵母的生長(zhǎng)及提高蘋果白蘭地的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前就關(guān)于氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究較多，而蘋果白蘭地中氮源添加對(duì)其發(fā)酵揮發(fā)性香氣成分形成的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)在前期優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上制得蘋果白蘭地，通過(guò)頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法分別測(cè)定有無(wú)氮源添加蘋果汁中發(fā)酵蘋果白蘭地酒的香氣成分，比較二者異同，揭示氮源對(duì)蘋果白蘭地發(fā)酵揮發(fā)性香氣成分的影響，對(duì)提高蘋果白蘭地酒的風(fēng)味具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母1023和1620：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；斜面培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然）；種子培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基（裝液量100 mL/250 mL，pH自然）；富士蘋果：采自于甘肅慶陽(yáng)西峰區(qū)；氯化銨（分析純）：天津奧博凱化工有限公司；焦亞硫酸鈉（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)固相微萃取（SPME）進(jìn)樣器，100 μm聚二甲基硅烷（polydimethylsilane，PDMS）萃取頭：美國(guó)Supelco公司；TRACE DSQ型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；B204LED型生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；TD50002型電子天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；Breville-BJE500F型榨汁機(jī)：澳大利亞鉑富公司；ZHJH-C11128型超凈工作臺(tái)、2WY-2102型恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；RE5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種制備

將釀酒酵母保藏菌種轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面，28 ℃培養(yǎng)48 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩谋４娴男泵媾囵B(yǎng)基中用接種環(huán)挑去6環(huán)菌苔接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

在前期優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上向蘋果白蘭地酒發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加250 mg/L氯化銨作為氮源并設(shè)置對(duì)照，分別裝于1 000 mL三角瓶，每瓶600 mL，重復(fù)3次。

1.3.4 蘋果白蘭地酒精發(fā)酵

將活化好的兩種釀酒酵母按照1∶1比例接種于600 mL蘋果白蘭地酒發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為6%，接種菌含量為106CFU/mL，然后于20 ℃厭氧靜置發(fā)酵6 d。

1.3.5 測(cè)定方法

樣品處理：先將SPME萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化1 h，老化溫度250 ℃，取蘋果白蘭地酒8 mL置于15 mL鉗口瓶中，加入2 g氯化鈉，用聚四氟乙烯隔墊密封，放入電子恒溫水浴鍋中加熱30 ℃平衡10 min后，通過(guò)隔墊將已老化好的100 μm PDMS萃取纖維頭插在樣品瓶中，保持在30 ℃恒溫頂空吸附40 min后，插入GC-MS進(jìn)樣口，于250 ℃解析5 min。

采用TRACEDSQ型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。

氣相色譜條件：程序升溫，起始溫度45 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持7 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度230 ℃，載氣氦氣，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣方式。

質(zhì)譜條件：電離方式電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu，發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur軟件，利用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)圖譜[7]，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算出蘋果白蘭地酒中各化學(xué)組分相對(duì)質(zhì)量百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果白蘭地GC-MS總離子流色譜圖

采用頂空固相微萃取法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)添加氮源及未添加氮源發(fā)酵蘋果白蘭地酒中的香氣成分進(jìn)行檢測(cè)，得到可揮發(fā)性香氣成分的保留時(shí)間（retention time，RT）及總離子流圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 添加(A)和未添加(B)氯化銨發(fā)酵蘋果白蘭地中揮發(fā)性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in apple brandy with ammonium chloride (A) and without ammonium chloride (B)

2.2 不同處理發(fā)酵蘋果白蘭地香氣成分分析

采用頂空固相微萃取，通過(guò)GC-MS對(duì)未添加（CK）和添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地中香味物質(zhì)進(jìn)行了分析研究，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，通過(guò)GC-MS分析，添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測(cè)得48種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)22種，相對(duì)含量為47.29%，醇類物質(zhì)8種，相對(duì)含量為26.12%，羧酸類物質(zhì)2種，相對(duì)含量為0.25%，烯烴類物質(zhì)2種，相對(duì)含量為0.83%，烷烴類物質(zhì)12種，相對(duì)含量為5.48%，其他香氣物質(zhì)2種，相對(duì)含量為0.22%；未添加氯化銨（CK）發(fā)酵的蘋果白蘭地經(jīng)鑒定共測(cè)得54種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類物質(zhì)22種，相對(duì)含量為42.55%，醇類物質(zhì)8種，相對(duì)含量為31.95%，羧酸類物質(zhì)4種，相對(duì)含量為0.77%，烯烴類物質(zhì)4種，相對(duì)含量為1.01%，烷烴類物質(zhì)12種，相對(duì)含量為5.59%，酮類物質(zhì)2種，相對(duì)含量為0.09%，其他香氣物質(zhì)2種，相對(duì)含量為0.11%。

表1 蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of aroma components in apple brandy

續(xù)表

2.3 不同處理發(fā)酵的蘋果白蘭地主體香氣成分對(duì)比分析

結(jié)合表1中蘋果白蘭地香氣成分GC-MS分析結(jié)果，對(duì)蘋果白蘭地酒中幾種主體香氣成分的作用和相對(duì)含量作了進(jìn)一步分析，結(jié)果如表2所示。

表2 蘋果白蘭地中主體香氣成分相對(duì)含量Table 2 Relative content of key aroma components in apple brandy

表2結(jié)果表明，不論對(duì)照組還是添加氯化銨發(fā)酵的蘋果白蘭地中，酯類是蘋果白蘭地中含量最多的揮發(fā)性化合物，其中相對(duì)含量較高的酯類物質(zhì)為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯；揮發(fā)性酯是組成香氣化合物的最重要種類，大多數(shù)酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯對(duì)酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[8-9]，如辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味；癸酸乙酯具有葡萄的香氣[10-11]。乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和異丁醇、異戊醇被認(rèn)為是構(gòu)成香氣的基本成分，而其他的揮發(fā)性組分只是補(bǔ)充、改善和修飾上述物質(zhì)所構(gòu)成的基本香氣成分[12]，蘋果白蘭地的香氣基本成分辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯及3-甲基-1-丁醇（異戊醇）在本研究中均被檢出且相對(duì)含量較高，這與其他研究結(jié)果有相同之處。醇類是第二大類揮發(fā)性化合物，其中相對(duì)含量較高的醇類物質(zhì)為3-甲基-1-丁醇、乙醇；一般醇類物質(zhì)都會(huì)給人帶來(lái)刺鼻的氣味，在果酒中會(huì)給酒香帶來(lái)負(fù)效應(yīng)影響，3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣能夠持久保持，所以常在食品工業(yè)和化工行業(yè)中用于調(diào)香[13]。綜上所述，揮發(fā)性酯類和醇類物質(zhì)是蘋果白蘭地?fù)]發(fā)性香氣物質(zhì)的主要種類。

從表2還可以看出，雖然對(duì)照組與添加組在主體揮發(fā)性物質(zhì)成分組成上具有一致性，但這些成分在相對(duì)含量上卻存在一定的差異，添加組中總的酯類物質(zhì)相對(duì)含量高于對(duì)照組，其含量分別為44.27%和38.61%；從單個(gè)酯類物質(zhì)來(lái)看，除了己酸乙酯以外，添加組中主要酯類物質(zhì)含量均高于對(duì)照組。

對(duì)于醇類物質(zhì)而言，添加組的乙醇相對(duì)含量和對(duì)照組相比增加，而3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對(duì)含量降低。異戊醇是高級(jí)醇的主要成分，但如含量過(guò)高，對(duì)人體有害，它的中毒和麻醉作用比乙醇強(qiáng)，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，令人頭痛，并且在體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，在機(jī)體內(nèi)的停留時(shí)間長(zhǎng)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，外加氮源對(duì)高級(jí)醇的生成有很好的抑制作用[15]，本研究結(jié)果顯示，添加外源氮可以提高蘋果白蘭地發(fā)酵酒精度和降低3-甲基-1-丁醇（異戊醇）的相對(duì)含量，這與有關(guān)報(bào)道研究結(jié)果相同，即培養(yǎng)基氮源不足，添加氮源可使高級(jí)醇含量降低。

3 結(jié)論

在蘋果白蘭地的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯類和醇類占的相對(duì)含量較高，構(gòu)成了蘋果白蘭地的主體香氣成分。

蘋果白蘭地發(fā)酵中添加氯化銨有助于提高主要酯類物質(zhì)的相對(duì)含量，降低異戊醇的相對(duì)含量，其中相對(duì)含量較高的香氣物質(zhì)為乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙醇。

本研究只是針對(duì)無(wú)機(jī)氮源對(duì)蘋果白蘭地香氣成分影響方面做了初步研究。尚需進(jìn)一步研究有機(jī)氮源、不同碳源、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加對(duì)蘋果白蘭地香氣成分的影響。

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