梁娜娜，劉 螢，王琳麗，王珮玥，呂美玲，王金花，張朝暉，韓 深*

（1.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026；2.安捷倫科技中國有限公司，北京 100102）

隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，葡萄酒受到了人們的熱捧。我國作為葡萄酒新興產業(yè)國家，其生產量和消費量呈現快速增長的趨勢，成為同類飲料行業(yè)中成長速度最快的子行業(yè)，而日益嚴重的葡萄酒真酒假標等不良現象已成為妨礙我國葡萄酒產業(yè)健康發(fā)展的關鍵問題。因此為了提高葡萄酒的質量，保障消費者買到貨真價實的葡萄酒，需要建立完善的葡萄酒質量保護和監(jiān)督體系，對葡萄酒進行原產地的保護，為葡萄酒真?zhèn)舞b別提供技術支撐。葡萄酒是在一定的氣候、土壤等生態(tài)條件下并通過相應的工藝進行釀造的結果。葡萄中重要的風味物質在釀酒過程中由果皮浸漬轉移到酒中，決定著葡萄酒的口感、香味及色澤，而原產地氣候環(huán)境、地質情況、土壤條件等環(huán)境因素極大地影響著葡萄酒的風味物質，進而影響葡萄酒的質量和風格，因此可通過分析這些風味物質來對不同產地葡萄酒進行鑒別[1-2]。近年來利用風味物質進行葡萄酒真?zhèn)舞b別系統(tǒng)的研究在國外迅速興起[3-6]，建立的鑒別系統(tǒng)大多數只適用于某地區(qū)或某些品種葡萄酒，與地區(qū)或企業(yè)對自身產品的保護、質量監(jiān)督有關[7-8]。SERRANO-LOURIDO D等[3]對西班牙佩內德斯（Penedes）、杜埃羅河岸（Ribera del Duero）和里奧哈（Rioja）三個重要的葡萄酒主產區(qū)的90款葡萄酒進行了產地分析與鑒別，并根據酚類物質進行了偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）的模型構建，判別準確率高達90%以上，而且利用質譜對模型鑒別的特征物質進行了鑒定，提出了每個產區(qū)的特征化合物。BELLOMARINO S A等[4]利用主成分分析和線性判別技術對來自澳大利亞吉朗（Geelong）和庫納瓦拉（Coonawarra）兩個主產區(qū)的赤霞珠葡萄酒成功進行了產區(qū)的鑒別分析，準確率高達91%[4]。SERAPINAS P等[5]采用電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）對來自智利、保加利亞、法國、匈牙利、意大利、西班牙、美國共7個國家的103 款葡萄酒進行了礦質元素的檢測分析，應用主成分分析發(fā)現，部分礦質元素可有效對不同國家的葡萄酒進行區(qū)分，準確率可達90%。KALLITHRAKA S等[6]基于風味物質結合感官分析結果，采用主成分分析技術成功鑒別了希臘北部和南部兩個原產地。

目前大部分研究人員集中探究葡萄酒成分的檢測分析，忽略了葡萄酒的顏色評價。顏色特征是葡萄酒的重要指標之一，常采用國際葡萄與葡萄酒組織（International Vine and Wine Organization，OIV）推薦的CIELab法進行葡萄酒顏色的檢測分析，引入葡萄酒的亮度（L*）、紅/綠顏色參數（a*）和黃/藍顏色參數（b*），通過視覺感知特定品質屬性色調（Tonality）、亮度（Luminosity）和色差（Chmmatism）來客觀評價葡萄酒的顏色[9]。本文采用高分辨率質譜進行葡萄酒代謝物輪廓分析，應用化學計量學工具和高級數據挖掘系統(tǒng)進行數據的篩選，分析了中國三個葡萄酒主產區(qū)和美國兩個酒莊的赤霞珠干紅葡萄酒，結合葡萄酒顏色評價有效進行了葡萄酒產區(qū)的鑒別，這將為葡萄酒的產地溯源提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來自中國三個主產區(qū)的赤霞珠（V.viniferaL.cv.Cabernet Sauvignon）干紅葡萄酒樣品共70支，分別是來自山東產區(qū)（CN-SD）20支酒、河北懷來產區(qū)（CN-HBHL）24支酒、河北昌黎產區(qū)（CN-HBCL）26支酒，這些酒樣由中糧葡萄酒有限公司、中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院提供。來自美國納帕峽谷（Napa valley，US）的兩個知名酒莊的赤霞珠干紅葡萄酒，分別是Robert Mondavi酒莊（US-RM）20支酒和V.Sattui酒莊（US-V.S）23支酒，這些酒樣由北京出入境檢驗檢疫局提供。以上樣品對于原產地的信息有足夠的代表性和真實性，置于酒柜冷藏待用。

甲醇、乙腈、乙酸銨均為色譜純：美國Fisher公司；甲酸（色譜純）：美國Tedia公司；實驗用水是經Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水（電阻率≤18.2 MΩ）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290系列超高壓液相色譜-Agilent 6530高分辨飛行時間質譜聯(lián)用儀（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectra，UPLC-QTOFMS）：美國安捷倫科技公司；Sartorius 1-14離心機：美國Sigma公司；Milli-Q凈化系統(tǒng)：美國Millipore公司；0.45 μm微孔濾膜：英國Whatman公司；UV-1800紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIELab法測定葡萄酒顏色

用蒸餾水作為參比，采用0.2 cm光程，取過濾后的葡萄酒樣品用分光光度計分別于波長440 nm、530 nm、600 nm處測定透光率并計算L*、a*和b*值[10]，樣品重復分析3次。

1.3.2 液相色譜質譜

葡萄酒樣品12 000 r/min離心10 min后經0.45 μm濾膜過濾，直接進入Agilent 1290 UPLC-QTOF-MS儀器檢測。

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相（A）：水溶液（含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）；流動相（B）：V（甲醇）∶V（水）=95∶5（含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，1%B；1～8 min，1%B～15%B；8～15 min，15%B～45%B；15～17 min，45%B～90%B；17～20 min，90%B。

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式：正離子（positive）全掃描模式；干燥氣溫度和流量：325 ℃和11 L/min；鞘氣溫度和流量：350 ℃和12 L/min；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；掃描方式：MS Scan（質荷比范圍100～1 100）和Targeted MS/MS（質荷比范圍50～1 100）；霧化器壓力：45 psig；碰撞電壓：130 V；采集速率：MS Scan（2 spec/sec）和Targeted MS/MS（3 spec/sec）；使用調諧液參比離子進行分子量實時較準，正模式參比離子：121.050 9和922.009 8。

1.3.3 數據處理與分析

數據采集：Agilent MassHunter Software Ver.B.05.00；數據處理：Mass Profiler Professional Ver.12.5；作圖軟件：SigmaPlot 10.0。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄酒主成分分析

所有葡萄酒樣品采用全掃模式進行檢測分析，經分子特征提?。╢ind by molecular feature）化合物后導入MPP軟件進行數據過濾。為了得到更有代表性的化合物，分別經頻率過濾、同組內數據變異系數、方差分析（P=0.01）和組間含量倍數差異（fold change，FC=3），得到每個組的特征物。主成分分析（principle component analysis，PCA）是一種能夠有效對數據進行降維的多元統(tǒng)計分析方法，以最少的信息丟失將原有變量濃縮并重新組合成互相無關的少數幾個綜合變量因子，可通過2-D和3-D的形式呈現更直觀的聚類結果[11-14]。中國三個主產區(qū)和美國兩個酒莊的赤霞珠干紅葡萄酒進行PCA分析得到4個主成分因子（principal component，PC），累積貢獻率52.93%，PC1、PC2、PC3和PC4的貢獻率分別為33.43%、8.02%、6.51%和4.97%。圖1呈現的是分別以兩個主成分子和三個主成分因子得到的2-D和3-D圖，可看出中國和美國的赤霞珠酒樣之間存在著明顯差異，中國三個產區(qū)的葡萄酒樣品點全部位于PC1的正半軸，美國兩個酒莊的樣品點全部位于PC1的負半軸，可根據樣品的PC1得分區(qū)別開。但中國的山東、河北昌黎、河北懷來三個葡萄酒主產區(qū)沒有分開，美國兩個酒莊也沒有分開，從葡萄酒風味物質的角度分析，葡萄酒在同一個國家不同產區(qū)之間的差異遠遠小于不同國家之間的差異，因此把兩個國家的五個產區(qū)共同進行主成分分析，國家差異得到較好地呈現，而同一個國家不同產區(qū)之間由于差異相對較小從而混雜在一起未得到較好的區(qū)分，這也是導致中國和美國赤霞珠葡萄酒累計貢獻率較低的原因。

圖1 中國三個產區(qū)和美國兩個酒莊赤霞珠干紅葡萄酒主成分分析2-D(A1)及3-D(A2)圖Fig.1 2-D (A1) and 3-D (A2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of three regions in China and two wineries in USA

因此為了對同一個國家不同產區(qū)進行區(qū)分，分別對中國三個葡萄酒產區(qū)、美國兩個酒莊的葡萄酒樣品進行了主成分分析，得到了較好的鑒別結果見圖2。圖2B1和圖2B2分別是中國三個葡萄酒產區(qū)主成分分析的2-D和3-D圖，得到的4個主成分因子貢獻率分別是44.04%、17.42%、8.47%和5.34%，累積貢獻率達75.27%。圖2B1可看出，河北昌黎產區(qū)樣品在PC1軸呈現較大負值，明顯與其他產區(qū)區(qū)分，山東產區(qū)酒樣較好地聚類在第四象限，河北懷來產區(qū)獨立聚類在第一象限，但樣品點分布相對較散，在圖2B2也可看出。河北懷來產區(qū)分布相對較散的樣品點可能與當地“V”型盆地造成的明顯微氣候差異有關。

圖2 中國三個產區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒主成分分析2-D(B1)及3-D(B2)圖Fig.2 2-D (B1) and 3-D (B2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of three regions in China

圖3 美國兩個酒莊赤霞珠干紅葡萄酒主成分分析2-D(C1)及3-D(C2)圖Fig.3 2-D (C1) and 3-D (C2) graph of PCA for Cabernet Sauvignon wines of two wineries in USA

圖3C1和圖3C2分別是美國納帕峽谷兩個葡萄酒莊的酒樣主成分分析的2-D和3-D圖，得到的4個主成分因子貢獻率分別是62.32%、7.39%、4.45%和3.56%，累積貢獻率達77.72%，可看出單獨對納帕峽谷兩個酒莊的樣品進行主成分分析，有明顯區(qū)別。根據實驗結果發(fā)現，對葡萄酒產區(qū)的鑒別需要逐層遞進地分析，先忽略小產區(qū)間的差異進行國家之間的鑒別，在此基礎上再進行該國內多個葡萄酒小產地的差異分析。

2.2 赤霞珠葡萄酒產區(qū)鑒別模型的構建

赤霞珠葡萄酒的PCA分析得到了較好的產區(qū)聚類結果，因此為了便于有效地進行聚類程度的評價和盲樣的鑒別，采用化學計量學軟件依據風味物質的分析結果進行產區(qū)鑒別模型的構建，常用的構建方式：偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、反向傳播人工神經網絡（back-propagation artificial neural network，BP-ANN）和樸素貝葉斯算法模型（Naive Bayes Model，NBM）構建。PLS-DA是一種基于特征變量用偏最小二乘法回歸作為核心算法的計算方法，在大量數據中根據組間的差異特征進行樣品分類[11-13]。BP-ANN是神經網絡模式識別系統(tǒng)中最廣泛使用的一種算法，包含輸入層、輸出層和隱含層三層網絡，是輸入信號正向傳播與誤差反向傳播的各層權值周而復始進行不斷調整的模型訓練過程[13-15]。NBM也是較為廣泛使用的分類模型，根據樣品的特征屬性進行劃分形成訓練樣本集合，通過每個樣品在各個類別的訓練樣本中的出現頻率及其特征屬性，估計每個樣品的概率。表1呈現的是中國三個產區(qū)和美國兩個酒莊赤霞珠干紅葡萄酒鑒別模型構建的三種算法計算結果，準確率由預測結果正確的樣品個數與總樣品個數比值得到，每個模型都是經交叉驗證逐步完善的。PLS-DA模型使用N-fold方式的交叉驗證程序，分成3份，重復運算10次。

由表1可看出，PLS-DA模型準確率達95.9%，河北昌黎產區(qū)和河北懷來產區(qū)僅各有2個樣品錯誤預測，而中國山東產區(qū)和美國兩個酒莊的準確率高達100%，但置信度（confidence）較低，僅約0.50，說明該模型對酒樣產地的判斷結果可信度較低。BP-ANN模型使用Leave one out的交叉驗證程序，運算速率0.7，迭代次數100，該模型準確度較低為66.3%，雖然河北昌黎產區(qū)和美國兩個酒莊的酒樣判別準確率達到了100%，但山東產區(qū)的準確率僅6.7%，15個酒樣中僅1個樣品判斷正確，而河北懷來產區(qū)的19個酒樣全部錯誤地判斷為河北昌黎產區(qū)。這兩個產地過低的準確率導致整個模型準確率下降，說明該模型不適用于這些產地的溯源。NBM模型使用Leave one out的交叉驗證程序，準確率92.9%，河北懷來產區(qū)和美國兩個酒莊的準確率達100%，山東產區(qū)和河北昌黎產區(qū)樣品的準確率約80%，而且置信度較高接近1.0，說明該模型可以準確地進行中國和美國赤霞珠葡萄酒的產地溯源。根據三種運算方式構建模型的準確率和置信度進行比較，選擇了樸素貝葉斯算法構建的中國和美國赤霞珠干紅葡萄酒真?zhèn)舞b別的NBM模型。

表1 中國三個產區(qū)和美國兩個酒莊赤霞珠干紅葡萄酒鑒別模型構建的三種運算方法結果Table 1 Model training and cross-validation results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China and two wineries in USA by three operation method

表2 中國三個產區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒鑒別模型構建的三種運算方法結果Table 2 Model training and cross-validation results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China by three operation method

由于進行了中國三個葡萄酒主產區(qū)的酒樣主成分分析和判別，因此同樣采用這三種運算方法其進行了產地鑒別模型的構建，結果見表2。PLS-DA模型使用N-fold方式的交叉驗證程序，分成5份，重復運算20次，三個產區(qū)的葡萄酒樣品判別準確率均達到100%，置信度0.60～0.90。BP-ANN模型使用Leave one out的交叉驗證程序，運算速率0.7，迭代次數100，該模型準確率98.0%，置信度0.95～0.99，山東和河北懷來產區(qū)的準確率達到100%，僅河北昌黎產區(qū)的準確率為95.2%。與PLS-DA和BP-ANN模型相比較，NBM模型錯誤地把三款山東產區(qū)的葡萄酒樣品聚類到河北懷來產區(qū)，準確率相對較低，但也達91.8%，置信度約1.0。因此對中國三個產區(qū)的赤霞珠葡萄酒進行產地鑒別時，主要采用BP-ANN模型。

2.3 不同產區(qū)葡萄酒CIELab顏色參數

圖3 不同產區(qū)葡萄酒CIELab顏色參數范圍Fig.3 Color values range for CIELab parameters in wines from different regions

利用PCA分析和化學計量學軟件對赤霞珠葡萄酒產地鑒別模型的成功構建，可看出不同產地的赤霞珠葡萄酒風味物質有著明顯差異，因此采用CIELab法進行葡萄酒色度色調的檢測分析，試圖在葡萄酒的外觀表現上分析產區(qū)的差異（見圖3）。L*代表葡萄酒的顏色深淺，a*、b*分別與紅綠顏色、黃藍顏色強度相關，圖3呈現的是不同產區(qū)葡萄酒CIELab顏色參數的范圍，可看出美國兩個酒莊赤霞珠干紅葡萄酒的三個顏色參數值范圍比較接近，且相對較高，說明這兩個酒莊生產的葡萄酒樣質量比較恒定，且葡萄酒顏色強度較深。中國的三個葡萄酒產區(qū)亮度較高，a*和b*顏色參數值范圍相對較低，說明與美國產區(qū)相比，中國葡萄酒的顏色強度相對較低。而且河北懷來產區(qū)的葡萄酒參數范圍較大，與PCA分析圖中懷來產區(qū)樣品點相對較散一致，可能受“V”型盆地的微氣候影響造成。

2.4 模型預測

選取15支中國產區(qū)的赤霞珠干紅葡萄酒，山東產區(qū)、河北懷來產區(qū)和河北昌黎產區(qū)各5支，采用中國三個產區(qū)的赤霞珠葡萄酒BP-ANN產地鑒別模型進行預測，結果見表3。由表3可知，除山東產區(qū)和河北昌黎產區(qū)各有1支酒被錯誤地預測為河北懷來產區(qū)，其余13支酒均準確地進行了預測，準確度達86.7%，且置信度較高，說明構建的BP-ANN鑒別模型可適用于中國這三個產區(qū)的赤霞珠葡萄酒產地溯源。

表3 中國三個產區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒BP-ANN鑒別模型的預測結果Table 3 Model prediction results of Cabernet Sauvignon dry red wines from three regions in China by BP-ANN

3 結論

近年來葡萄酒的產地溯源已經成為妨礙葡萄酒市場發(fā)展的關鍵問題，本研究應用UPLC-QTOF-MS對葡萄酒風味物質進行了代謝輪廓分析，采用化學計量學工具成功進行了中國三個產區(qū)和美國兩個酒莊赤霞珠葡萄酒產地溯源的PCA分析和模型構建，同時根據CIELab法進行葡萄酒顏色參數分析，從外觀表現上也可看出葡萄酒產區(qū)間的差異。根據準確度和置信度比較了偏最小二乘法判別分析、反向傳播人工神經網絡和樸素貝葉斯算法三種方法構建模型的優(yōu)劣，并應用構建的模型有效進行了葡萄酒盲樣的產地鑒別，準確率達86.7%。但目前建立的模型樣本量較少，在未來研究中隨著樣本量的擴充將會逐步完善產地鑒別模型，為產地溯源工作奠定基礎。

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