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金沙窖酒酒醅中產(chǎn)香酵母分離與鑒定

2014-04-12 06:09王曉丹魏燕龍邱樹毅
中國釀造 2014年12期
關(guān)鍵詞:瓊脂酵母菌酵母

龐 博,王曉丹,魏燕龍,邱樹毅*

(1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州金沙窖酒酒業(yè)有限公司,貴州金沙 551800;3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025)

以微生物菌種為核心的發(fā)酵工業(yè),其菌種是關(guān)鍵[1],目前的產(chǎn)香酵母主要屬于產(chǎn)酯酵母和假絲酵母,是中國白酒中酯香的主要產(chǎn)生菌[2],主要能為不同種類的白酒產(chǎn)酯增香,去除雜味,協(xié)調(diào)酒體,改善白酒的質(zhì)量[3],除了在白酒生香中有的廣泛應(yīng)用,也逐漸適用于香料、果汁、食醋的生產(chǎn)加工中,所以具有高產(chǎn)酯能力、各種酯組合優(yōu)化的產(chǎn)酯產(chǎn)香酵母的選育,是目前釀造行業(yè)急需研究且非常有意義的課題[4]。

本實驗主要從醬香型大曲酒的大曲和酒醅中分離具有高產(chǎn)酯增香功能的酵母,進(jìn)行發(fā)酵實驗并對菌種進(jìn)行鑒定、保藏,也為利用該菌種進(jìn)行原生質(zhì)體融合來選育能夠產(chǎn)香的釀酒酵母奠定基礎(chǔ)。本研究對該菌種的生物學(xué)特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究,并通過分子生物學(xué)手段進(jìn)行初步鑒定,為后期進(jìn)一步研究和在白酒中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅、大曲:金沙窖酒酒業(yè)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)分離培養(yǎng)基

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基[5]:蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,磷酸二氫鉀1 g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g,瓊脂20 g,1/3 000孟加拉紅溶液100 mL,蒸餾水1 000 mL,氯霉素0.1 g。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基[6]:馬鈴薯汁1 000 mL,葡萄糖20 g,瓊脂20 g。

(2)富集培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基:麥芽汁70 mL,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[7]:麥芽汁150 mL,瓊脂3 g,pH 自然,121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯20 g,葡糖糖2.0 g,瓊脂1.5 g,蒸餾水100 mL,pH值自然。

(3)篩選培養(yǎng)基

小麥高粱培養(yǎng)基:小麥∶高粱的質(zhì)量比為1∶1,其中整粒高粱∶碎粒質(zhì)量比為3∶1,小麥全部粉碎,攪拌均勻后90 ℃潤糧5 h,高溫蒸汽,121 ℃滅菌20 min,裝瓶。

(4)鑒定培養(yǎng)基

玉米粉瓊脂培養(yǎng)基:在60 g 玉米粉中加入少量水調(diào)成糊狀,再加水至1 000 mL,攪拌均勻后80~90 ℃水浴1.5 h,之后過濾(中間攪拌3~4 次),濾液補(bǔ)加水至1 000 mL,再加瓊脂15 g,加熱融化,趁熱用脫脂棉過濾,分裝到試管和三角瓶內(nèi),113 ℃滅菌30 min。

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基:0.1%葡萄糖,0.18%氯化鉀,0.25%酵母膏,0.82%醋酸鈉,2%瓊脂,以蒸餾水1 000 mL配制,113 ℃滅菌30 min。

豆芽汁培養(yǎng)基:10%豆芽汁、0.5%葡萄糖,蒸餾水100 mL調(diào)配,pH 值自然。

酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基:2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏、2%瓊脂、蒸餾水100 mL配制。

尿素培養(yǎng)基[8]:蛋白胨0.1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸二氫鉀0.2 g、尿素0.2 g、葡萄糖0.01 g、蒸餾水100 mL、酚紅(0.2%)0.4 mL、瓊脂2%,調(diào)pH至7.2 后過濾,121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

EXTaq酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、10×PCR Buffer:寶生物工程(大連)有限公司;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers,ITS)引物:Invitrogen 合成;Marker(DL 2000):上海欣百諾生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DY-CX1A電泳儀:上海趙迪生物科技有限公司;ABI PCR 儀:北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司;ABI 3730XL 測序儀:北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司;TDZ5-WS離心機(jī):上海喬躍電子有限公司;SZX-IS1A恒溫培養(yǎng)箱:北京陸??萍加邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母的分離與篩選

(1)初篩

酒醅樣粉碎,分別取25.0 g粉碎樣品于三角瓶中,并加225 mL無菌生理鹽水及玻璃珠,搖床中振蕩搖勻30 min。無菌條件下吸取1 mL菌懸液于裝有9 mL生理鹽水的試管中,進(jìn)行系列稀釋,取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度進(jìn)行平板涂布于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上。28 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d后挑取平板中酵母單菌落,于10 mL生理鹽水中制成菌懸液,再稀釋涂布到PDA固體培養(yǎng)基上,重復(fù)3~4次,直至獲得純菌種,分別斜面劃線低溫保藏。

(2)復(fù)篩

分別把初篩分離得到的菌株接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)36 h后吸取4 mL菌液接種到盛有200 g高粱小麥培養(yǎng)基的三角瓶中,加入20 000 U糖化酶。模擬醬香白酒窖池內(nèi)33 ℃發(fā)酵25 d,蒸酒,感官評定,初步篩選產(chǎn)香酵母。

1.3.2 GC-MS分析

通過GC-MS對產(chǎn)香酵母制備的酒樣進(jìn)行風(fēng)味成分檢測。分別取產(chǎn)香酵母所發(fā)酵的酒樣1 g,置于4 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2 cm~50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進(jìn)樣器,在85 ℃頂空萃取30 min取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中,熱解析3 min進(jìn)樣。

色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱溫45 ℃,保留2 min,以4 ℃/min升溫至220 ℃,保持2 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He(純度≥99.999%);柱前壓7.62 psi,載氣流量1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣;溶劑延遲時間1.5 min。離子源為電子電離(electron ionization,EI)源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1 125 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍20~450 amu。

對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,確定了揮發(fā)性化學(xué)成分,用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對含量。

1.3.3 產(chǎn)醬香酵母的形態(tài)特征

(1)菌落形態(tài)觀察

將分離接種純化過的菌株接種于最小必需培養(yǎng)基(minimum essential medium,MEA)固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落形態(tài)。

(2)細(xì)胞形態(tài)觀察

將分離接種純化過的菌株接種于MEA 斜面培養(yǎng)基上,28 ℃倒置培養(yǎng)36 h,無菌條件下用接種環(huán)挑取少許菌體置于載玻片上的無菌水中,蓋上蓋玻片,于顯微鏡下觀察。

(3)假菌絲觀察[9]

將分離接種純化過的菌株接種在玉米粉瓊脂平板上28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察假菌絲有無。

(4)子囊孢子的觀察[10]

將分離接種純化過的菌株接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基斜面上,28 ℃培養(yǎng)7 d后用接種環(huán)挑取少量生長在葡萄糖醋酸鹽培養(yǎng)基中的釀酒酵母于載玻片上,制片,干燥、固定后用孔雀綠芽孢染液染色,晾干之后于油鏡下觀察子囊孢子。

1.3.4 產(chǎn)香酵母的代謝實驗

(1)糖發(fā)酵實驗[11]

為制備碳源饑餓酵母,將純化過的酵母于25 ℃在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上饑餓培養(yǎng)3 d,后2.5%的接種量接種到12.5%豆芽汁中(加20 g/L葡萄糖),28 ℃靜置發(fā)酵14 d,每天觀察其產(chǎn)氣狀況。

(2)硝酸鹽利用實驗[12]

為制備氮源饑餓酵母,將純化過的酵母先在25 ℃用碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)5~7 d后稀釋涂布于碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上,并點少量硝酸鹽于平板上,25 ℃培養(yǎng)3 d,觀察試劑周圍是否有酵母菌落生長。

(3)產(chǎn)類淀粉化合物測定實驗[12]

純化過的酵母接種在蛋白胨酵母膏葡萄糖(YPD)培養(yǎng)液中,28 ℃培養(yǎng)5~6 d后加入1滴Lugol’s 碘液,觀察是否產(chǎn)類淀粉化合物。

(4)脲酶實驗[12]

純化過的酵母接種于水解尿素實驗的瓊脂斜面上28 ℃培養(yǎng)6~7 d,觀察是否分解尿素。

1.3.5 產(chǎn)香酵母的ITSrDNA PCR測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

提取樣品基因組DNA,PCR引物:ITS1:(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'),ITS4:(5'-TCCCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。模板DNA 5 μL,反應(yīng)體系50 μL,PCR Premix 25 μL,引物ITS1和ITS4各0.5 μL,將ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃5 min,94 ℃1 min,55 ℃1 min,72 ℃1 min,30個循環(huán)后瓊脂糖凝膠電泳檢測。將測序結(jié)果利用Blast 程序搜索同源序列,以Clustal X 軟件進(jìn)行多重序列比對[13],再用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母的感官評定

經(jīng)過初篩,共從大曲、酒醅中分離出12株菌落形態(tài)不同的菌株,可將其分為3類,其菌落形態(tài)描述見表1。

表1 酵母菌菌落形態(tài)描述Table 1 Colony morphology of yeasts

為了研究表1中12株3類不同酵母發(fā)酵產(chǎn)酒情況,將該12株酵母按照1.3.1的方法進(jìn)行實驗室模擬發(fā)酵產(chǎn)酒,并感官評定,其中氣味強(qiáng)度按照數(shù)字1~10氣味強(qiáng)度逐漸升高,結(jié)果如表2所示。

由表2可知,總體可接受性最大的為11號酵母,總體可接受性>5的酵母為11號、10號、6號、2號酵母菌株,初步篩選出該4株產(chǎn)香功能酵母,進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 不同酵母發(fā)酵產(chǎn)酒樣感官評定Table 2 Sensory evaluation of liquor samples

2.2 GC-MS分析

為分析初篩中4株酵母實驗室模擬發(fā)酵所蒸餾的酒樣中的風(fēng)味成分,對酒樣進(jìn)行了GC-MS分析,在4株酵母中對比篩選出1株產(chǎn)香優(yōu)勢酵母FBKL2.0011,其GC-MS分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 FBKL2.0011發(fā)酵酒樣揮發(fā)成分GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS analysis results of aroma components of liquor sample fermented by strain FBKL2.0011

通過GC-MS總離子流圖譜進(jìn)行解析后,在FBKL2.0011菌株發(fā)酵制備的酒樣中共鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì),結(jié)果見表3。

由表3可知,F(xiàn)BKL2.0011菌株發(fā)酵酒樣中共檢出43種香氣成分,包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發(fā)性物質(zhì)中以醇類的含量最多,其中乙醇相對含量32.202%;其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達(dá)8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質(zhì)共同形成了白酒香氣。

表3 FBKL2.0011菌株發(fā)酵制備的酒樣中香氣物質(zhì)組成Table 3 Aroma compositions in liquor sample produced by strain FBKL2.0011

續(xù)表

2.3 產(chǎn)香酵母的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察

菌株FBKL2.0011在MEA固體培養(yǎng)基上,28 ℃倒置培養(yǎng)3 d,其菌落形態(tài)結(jié)果見表4及圖2。

表4 FBKL2.0011菌株在MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的菌落形態(tài)Table 4 Colonial morphology of strain FBKL2.0011 cultured in MEA medium for 3 d

圖2 FBKL2.0011的菌落形態(tài)(A)及鏡檢圖(B)Fig.2 Colonial morphology (A) and microscopy examination (B) of strain FBKL2.0011

2.3.2 酵母菌部分代謝實驗

對酵母菌株FBKL2.0011進(jìn)行生理生化特性試驗,其結(jié)果見表5。

表5 酵母菌生理生化特性形態(tài)Table 5 Physiological and biochemical properties of yeasts

由表5可知,酵母菌株FBKL2.0011無孢子,能利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生香氣成分,不能利用硝酸鹽,不產(chǎn)類淀粉物質(zhì)及不能分解尿素。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步確定該酵母的分類地位,又在形態(tài)學(xué)和生理生化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。采用ITS序列分析方法,對菌株DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增出的核酸片斷與Marker條帶比較,有一條明亮的PCR 特征性條帶,如圖3所示,并且其分子質(zhì)量大小與預(yù)測的理論值基本相符,菌株FBKL2.0011的PCR產(chǎn)物片段大小為817 bp。利用Blast程序與GenBank 中已登錄的基因序列進(jìn)行比對,獲得已定名的與之相似的屬、種的相關(guān)信息。構(gòu)建發(fā)育樹和同源性分析結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株FBKL2.0011 與uncultured compost fungus 同源性最高為99%。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of PCR products

圖4 菌株FBKL2.0011的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequences of strain FBKL2.0011

通過以上形態(tài)、生理學(xué)特征采用《酵母菌特征及鑒定手冊》介紹的方法[15]對該酵母分類,并結(jié)合其分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,判斷判菌株FBKL2.0011 為酵母屬(Saccharomyces)。

3 結(jié)論

從金沙窖酒酒醅中分離到一株產(chǎn)香菌株,通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗和分子生物學(xué)鑒定,確定FBKL2.0011為酵母屬(Saccharomyces)。FBKL2.0011菌株發(fā)酵酒樣中共檢出43種香氣成分,包括醇類、酸類、醛類、酯類、酮類、烯烴類、芳香類化合物及烷烴類。揮發(fā)性物質(zhì)中以醇類的含量最多,其中乙醇相對含量32.202%;其次是酯類如乙酸乙酯相對含量達(dá)8.009%。以醇類和酯類為主的香氣物質(zhì)共同形成了白酒香氣。

今后將對該菌與實驗室篩選的功能細(xì)菌和霉菌聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行研究與優(yōu)化,期望發(fā)現(xiàn)能夠提高白酒生產(chǎn)過程中的高級醇和酯類含量的一種方法。

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