陳勇 彭勇 于靜雅 鄔秀娣 羅晶 張振 干敏芝 黃嫻倩 章海均

RNA干擾HIF-1α對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的VEGF表達及增殖的影響

陳勇 彭勇 于靜雅 鄔秀娣 羅晶 張振 干敏芝 黃嫻倩 章海均

目的 探討shRNA特異性干擾沉默缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）對類風濕關節(jié)炎（RA）成纖維樣滑膜細胞（FLS）的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達及其增殖的影響。方法獲取9例RA患者滑膜組織進行RA-FLS的分離培養(yǎng)及傳代。將FLS分為4組：常氧組、缺氧組、陰性質粒組（轉染陰性質粒）和陽性質粒組（轉染HIF-1α陽性質粒），常氧組進行常規(guī)培養(yǎng)，后3組進行缺氧培養(yǎng)12h；采用Western blot和qRT-PCR法分別檢測各組FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達情況。將缺氧組、陰性質粒組和陽性質粒組的FLS分別于缺氧條件下培養(yǎng)6、12、24、48h，應用MTT比色法檢測各組細胞增殖情況。結果與常氧組相比，缺氧組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05），而陰性質粒組和缺氧組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達水平無明顯差異（P＞0．05）；陽性質粒組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA較缺氧組下調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05）。4組FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表達呈正相關（P＜0．01）。缺氧培養(yǎng)12h后陽性質粒組的FLS生長較缺氧對照組及陰性質粒組減慢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），而后兩組FLS生長無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。結論RNA干擾HIF-1α表達能有效下調RA-FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA水平，并且能抑制FLS的異常增殖。

類風濕關節(jié)炎 成纖維樣滑膜細胞 RNA干擾 細胞增殖 缺氧誘導因子-1α 血管內(nèi)皮生長因子

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種常見的以關節(jié)滑膜炎為特征，以慢性、進行性、侵襲性關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，是造成我國人群致殘的主要原因之一。目前對于RA的發(fā)病機制尚未十分清楚，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成。早在上世紀80年代Fassbender等[1]發(fā)現(xiàn)RA成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）具有類腫瘤生長特性，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)RA-FLS類似腫瘤細胞樣的生物學特性表現(xiàn)為FLS的異常增殖、遷移和浸潤及抗凋亡[2]。而RA的滑膜炎就主要表現(xiàn)為滑膜異常增生、炎癥細胞的浸潤及炎癥因子的釋放，這些又將引起關節(jié)微環(huán)境的缺氧[3]，體內(nèi)細胞缺氧反應的核心調節(jié)因子是缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）[4]。血管翳的形成是RA的另一重要病理表現(xiàn)，也是RA發(fā)生、發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為新生血管的形成。而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一種較強的刺激血管新生的因子，在血管新生中起著核心的作用；關節(jié)微環(huán)境的缺氧就是VEGF表達的主要誘導因素之一。我們前期研究結果也發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下RA患者滑膜細胞的HIF-1α及VEGF表達水平較骨關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）患者顯著升高，且兩者水平呈密切相關[5]。因此，筆者推測“缺氧-HIF-1α-VEGF”這一信號途徑在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關重要的作用，而HIF-1α又在其中起著核心作用。因此，本研究擬通過體外應用RNA干擾技術特異性靶向抑制RA-FLS的HIF-1α基因，探討缺氧條件下其對RA-FLS的VEGF表達及增殖的影響，從而為RA的靶向治療提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2012-03—2013-05寧波市第二醫(yī)院及寧波市第六醫(yī)院行關節(jié)置換術的RA患者的滑膜組織9例（寧波市第二醫(yī)院6例，寧波市第六醫(yī)院3例），其中男2例，女7例，年齡42～64歲，平均（54.3±10.5）歲。診斷符合2010年美國風濕病學會/歐洲風濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）的類風濕關節(jié)炎分類標準[6]。本實驗經(jīng)兩家醫(yī)院倫理委員會批準，術前獲患者同意并簽署知情同意書。獲取滑膜組織后將其保存于無血清的DMEM培養(yǎng)基中，2h內(nèi)冰盒運送至實驗室處理。

1.2 主要試劑 眼科剪；眼科鑷；細胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶（美國NUNC公司）；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）（美國Hyclone/Thermo Scientific公司）；Tris-HCl緩沖液（TBS）及含0.2%吐溫的TBS緩沖液（TBST）、總蛋白提取試劑盒（上海索萊寶公司）；HIF-1α-shRNA重組質粒、質粒提取試劑盒、轉染試劑Effectene Transfection Reagent（德國Qiagen公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；兔抗人HIF-1α多克隆抗體（一抗，美國Cell Signaling公司）；兔抗人VEGF多克隆抗體（一抗，美國Canta Cruz公司）；兔抗人β-actin單抗（一抗）及鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；Western Bright Quantum增強型發(fā)光底物（APG BIO環(huán)亞生物科技有限公司）；總RNA提取劑（日本Takara公司）；RNA逆轉錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒、MTT試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細胞培養(yǎng) 在生物安全柜內(nèi)無菌條件下，用眼科剪和鑷去除滑膜組織塊表面血污及脂肪組織，PBS緩沖液清洗2遍。將組織塊轉移至新的盛有DMEM培養(yǎng)基（含抗生素）的培養(yǎng)皿內(nèi)，將滑膜組織塊剪成1mm3；用槍頭將組織塊擺放至25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，組織間隔1cm，將培養(yǎng)瓶倒置（組織塊面朝上）于細胞培養(yǎng)箱中。孵育4h后向瓶內(nèi)加入5ml DMEM培養(yǎng)基 (含15%FBS和青、鏈霉素)，然后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉讓培養(yǎng)基浸沒組織塊，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后換液，以后每隔2～3d換液。培養(yǎng)期間偶有組織塊離壁、漂浮，即時換液去除漂浮組織塊。待細胞生長密度至90%，1∶2常規(guī)消化傳代。實驗所用RA-FLS均采用第3～5代細胞。

1.3.2 細胞轉染 將HIF-1α-shRNA（攜帶綠色銀光蛋白，GFP）重組質粒和陰性質粒進行擴增和提取。將滑膜細胞分為常氧組、缺氧組、陽性質粒組和陰性質粒組；常氧組和缺氧組未處理，常氧組作為空白對照；陽性質粒組轉染HIF-1α-shRNA陽性質粒，陰性質粒組轉染陰性質粒（即無關序列組）。細胞轉染參考Effectene Transfection Reagent轉染試劑盒并做條件優(yōu)化處理，熒光顯微鏡下觀察轉染率并取最佳優(yōu)化條件進行轉染。轉染4～6h后對各組細胞進行換液，繼續(xù)常規(guī)條件下培養(yǎng)24h后。然后將常氧組繼續(xù)常氧條件下培養(yǎng)12h，其余3組轉移至缺氧條件下（1%O2）培養(yǎng)12h。

1.3.3 Western blot檢測HIF-1α及VEGF的表達 分別收集上述4組滑膜細胞并提取各組細胞總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。取30μg總蛋白進行蛋白電泳：分離膠恒壓80V 20min，濃縮膠恒壓100V 90min；轉膜：轉膜前將濾紙于轉移緩沖液中平衡20min，恒流41 mA半干轉2h，將蛋白轉到PVDF膜上；封閉：將膜置于5%BSA封閉液中封閉1h，采用TBST洗膜2次，10min/次，TBS洗膜1次，10min；加待測的相應目的蛋白的一抗（抗HIF-1α或抗VEGF抗體），4℃過夜孵育，同上洗膜；加二抗，室溫孵育1h，同上洗膜。ECL發(fā)光劑發(fā)光，Tanon-4200 SF全自動數(shù)碼凝膠成像儀中，CCD曝光成像。凝膠圖像分析軟件對結果進行吸光度掃描，以βactin做內(nèi)參進行校正，以HIF-1α和VEGF蛋白條帶的吸光度值比上各自β-actin的吸光度值為目的蛋白的相對表達量。

1.3.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）HIF-1α及VEGF mRNA表達 分別收集上述4組滑膜細胞并提取細胞總RNA，測定RNA濃度。取2μg上述總RNA在MMLV逆轉錄酶作用下將其合成cDNA。采用qRT-PCR法檢測4組滑膜細胞HIF-1α和VEGF mRNA相對表達量。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因核苷酸序列，采用分子生物學軟件Primer5進行qRT-PCR擴增引物的設計，將設計好的引物送上海生物工程有限公司合成。引物序列：HIF-1α上游引物：TTGCTCATCAGTTGCCACTTCC，HIF-1α下游引物：AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC，產(chǎn)物長度153bp。VEGF上游引物：AAGGAGGAGGGCGAGAATCAT。VEGF下游引物：GCAGTAGCTGCGCTGATAGA，產(chǎn)物長度 66bp。設GAPDH為內(nèi)參基因，上游引物：GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC，GAPDH下游引物：AATGAAGGGGTCATTGATGG，產(chǎn)物長度110bp。根據(jù)qRT-PCR試劑盒操作，反應體系為25μl，每個樣品設3個復孔。qRTPCR反應條件為：95℃4min預變性；95℃15s變性，65℃30s退火，72℃30s延伸，共40個循環(huán)。qRT-PCR檢測CT值，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，△△Ct=實驗組基因△Ct值-對照組基因△Ct值，△Ct=目的基因△Ct-內(nèi)參基因△Ct值。

1.3.5 MTT比色法檢測細胞增殖活性 將滑膜細胞分為缺氧組、陽性質粒組和陰性質粒組，取1×104個/孔分別接種于96孔培養(yǎng)板，并設空白調零孔，缺氧組為對照組，培養(yǎng)12h貼壁。其余組同上進行細胞轉染，每組做5個復孔，于缺氧條件下分別培養(yǎng)6、12、24、48h。向各孔加入0.5mg/ml的MTT試劑20μl，37℃反應4h后棄去孔內(nèi)液體；加入二甲基亞砜200μl終止反應，酶標儀測定在570nm波長處測定各孔吸光度值（A）。以A值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞曲線。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；兩組間比較采用t檢驗。相關性分析采用Person相關分析。

2 結果

2.1 轉染shRNA后對RA-FLS中HIF-1α和VEGF表達的影響 通過熒光顯微鏡可觀察到轉染后細胞表達shRNA質粒攜帶的綠色熒光蛋白，詳見圖1。

圖1 HIF-1α-shRNA轉染前后FLS（A：轉染前普通光鏡下RA-FLS；B：轉然后熒光顯微鏡下RA-FLS表達綠色熒光蛋白；倒置顯微鏡，×40）

Western blot檢測結果顯示，缺氧組的HIF-1α和VEGF表達較常氧組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與陰性質粒組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；陽性質粒轉染組HIF-1α和VEGF表達較缺氧組下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時也發(fā)現(xiàn)常氧組兩種蛋白幾乎不表達，詳見圖2。

2.2 轉染shRNA后對RA-FLS中HIF-1α和VEGF mRNA表達水平的影響 缺氧組的HIF-1α和VEGF mRNA與常氧組相比表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與陰性質粒組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而陽性質粒組的HIF-1α和VEGF mRNA表達較缺氧組水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時也發(fā)現(xiàn)常氧組的HIF-1α和VEGF mRNA幾乎不表達，詳見圖3。GAPDH內(nèi)參、HIF-1α和VEGF的qRT-PCR產(chǎn)物的溶解均呈單峰，說明實驗特異性較高、結果可靠。

2.3 RA-FLS中HIF-1α和VEGF表達水平的相關分析 通過對常氧組、缺氧組、陰性質粒組和陽性質粒組FLS中HIF-1α及VEGF表達情況進行相關分析，結果表明兩者表達呈正相關（r=0.89，P＜0.01），詳見圖4。同時對上述4組FLS中HIF-1α和VEGF mRNA表達情況進行相關分析，結果表明兩者表達呈正相關（r=0.79，P＜0.01），詳見圖5。

圖2 各組FLS中HIF-1α和VEGF表達（與常氧組相比，*P＜0.05；與缺氧組相比，#P＜0.05）

圖3 各組FLS中HIF-1α和VEGF mRNA的表達（與常氧組相比，*P＜0.05；與缺氧組相比，#P＜0.05）

圖4 HIF-1α和VEGF表達水平相關關系

2.4 轉染shRNA后對RA-FLS增殖的影響 MTT法檢測缺氧組、陰性質粒組和陽性質粒組滑膜細胞缺氧不同時間后的增殖情況發(fā)現(xiàn)，從缺氧12h開始陽性質粒組的滑膜細胞生長較缺氧對照組和陰性質粒組明顯減慢，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；而后兩組滑膜細胞生長速度無統(tǒng)計學差異，詳見圖6。

圖5 HIF-1α和VEGF mRNA表達水平相關關系

圖6 HIF-1αshRNA干擾對缺氧條件下RA-FLS增殖的影響

3 討論

RA最大的危害在于其致殘性，即可導致患者關節(jié)破壞和畸形。目前有大量研究都認為活化的RA-FLS在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中起至關重要的作用，其具有類腫瘤生長特性即侵蝕性，是RA患者關節(jié)軟骨與骨破壞的主要參與者[7-8]，而滑膜炎和血管翳的形成是RA的基本病理表現(xiàn)。RA關節(jié)滑膜炎主要表現(xiàn)在炎癥關節(jié)中的大量炎癥細胞浸潤、炎癥因子的產(chǎn)生及滑膜細胞的異常增生，而這些都將導致RA關節(jié)微環(huán)境的缺氧，從而誘導滑膜組織的HIF-1α高表達。目前研究已經(jīng)證實，RA受累關節(jié)微環(huán)境中存在缺氧[9]。而Brouwer等[10]研究也發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織的HIF-1α表達水平顯著高于OA患者滑膜組織，還發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織HIF-1α陽性細胞數(shù)與其血管數(shù)目、炎癥細胞浸潤數(shù)及滑膜炎癥得分成正相關。國內(nèi)學者也發(fā)現(xiàn)，早期活動組RA患者的血清HIF-1α要顯著高于OA患者組及健康對照組，并且高于中晚期活動組及穩(wěn)定組RA患者[11]。血管翳的形成則是RA發(fā)生、發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為新生血管的形成。Ozgonenel等[12]發(fā)現(xiàn)RA患者的血清和滑液中VEGF水平顯著升高，并且VEGF水平與疾病的活動有關。而關節(jié)微環(huán)境的缺氧是VEGF及其受體表達的主要誘導因素之一。近年來一些針對缺氧核心調節(jié)因子HIF-1α的抑制劑被也證明對炎癥性關節(jié)有效，如Shankar等[13]應用二苯甲酮類似物（BP-1）處理佐劑誘導型關節(jié)炎（AIA）大鼠模型后，BP-1可下調早期關節(jié)炎大鼠VEGF和HIF-1α的表達，同時可減輕關節(jié)癥狀。Chou等[14]報道向AIA大鼠模型關節(jié)中注入透明質酸可以抑制其HIF-1α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、MMP-3的表達同時還可減輕關節(jié)疼痛。這些都表明HIF-1α可能參與了RA的發(fā)病過程，并且起著重要作用。

本研究通過對RA滑膜組織的成纖維樣滑膜細胞進行體外分離培養(yǎng)，并應用shRNA對其HIF-1α基因進行特異性干擾，檢測常氧和缺氧條件下HIF-1α shRNA對RA滑膜細胞的HIF-1α和VEGF蛋白及其mRNA表達，同時觀察其對滑膜細胞增殖的影響。結果顯示，缺氧組的RA滑膜細胞HIF-1α和VEGF及其mRNA表達水平要顯著高于常氧組，而兩者在常氧條件下幾乎不表達；通過HIF-1α shRNA干擾后發(fā)現(xiàn)陽性質粒組滑膜細胞的HIF-1α和VEGF及其mRNA水平較缺氧組對照組有所下調，并且通過相關分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF的表達呈正相關。這表明RA炎癥關節(jié)微環(huán)境的缺氧可以通過上調HIF-1α表達從而誘導滑膜細胞表達VEGF，進而可能加劇滑膜炎癥。通過干擾抑制滑膜細胞不僅可以下調VEGF的表達，本研究還發(fā)現(xiàn)陽性質粒組的滑膜細胞與對照組相比生長受到抑制。這表明下調滑膜細胞的HIF-1α表達可能可以延緩滑膜炎癥并且抑制滑膜細胞的異常增殖從而達到控制和治療疾病的目的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)條件下RA-FLS中HIF-1α和VEGF的表達升高，而通過HIF-1α-shRNA體外特異性抑制RA-FLS的HIF-1α表達，不僅可以抑制FLS的HIF-1α的表達從而下調RA血管新生的核心調節(jié)因子-VEGF，并且可以抑制缺氧條件下RA-FLS的異常增殖，提示以HIF-1α為靶向的RNA干擾治療RA的有效性。我們進一步擬應用病毒載體轉染HIF-1α shRNA，在RA動物模型中進一步明確RNA干擾HIF-1α的有效性和安全性，為臨床治療RA提供新的策略和依據(jù)。

[1]Fassbender H G,Simmling-Annefeld M．The potential aggressiveness of synovial tissue in rheumatoid arthritis[J]．J Pathol, 1983,139(3):399-406．

[2]Karouzakis E,Gay R E,Gay S,et al．Epigenetic control in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J]．Nat Rev Rheumatol,2009,5(5): 266-272．

[3]Biniecka M,Kennedy A,Fearon U,et al．Oxidative damage in synovial tissue is associated with in vivo hypoxic status in the arthritic joint[J]．Ann Rheum Dis,2010,69(6):1172-1178．

[4]Muz B,Khan M N,Kiriakidis S,et al．Hypoxia．The role of hypoxia and HIF-dependent signalling events in rheumatoid arthritis[J]．Arthritis Res Ther,2009,11(1):201．

[5]彭勇,陳勇,鄔秀娣,等．HIF-1α及VEGF在類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義[J]．浙江醫(yī)學,2013,35(18):1628-1631,1643．

[6]Aletaha D,Neogi T,Silman A J,et al．2010 Rheumatoid arthritis classification criteria:an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative[J]．Arthritis Rheum,2010,62(9):2569-2581．

[7]Huber L C,Distler O,Tarner I,et al．Synovial fibroblasts:key players in rheumatoid arthritis[J]．Rheumatology(Oxford),2006,45(6): 669-675．

[8]Bartok B,Firestein G S．Fibroblast-like synoviocytes:key effector cellsinrheumatoidarthritis[J]．ImmunolRev,2010,233(1):233-255．

[9]Sivakumar B,Akhavani M A,Winlove C P,et al．Synovial hypoxia asa cause of tendon rupture in rheumatoid arthritis[J]．J Hand Surg Am,2008,33(1):49-58．

[10]Brouwer E,Gouw A S,Posthumus M D,et al．Hypoxia inducible factor-1-alpha (HIF-1alpha)is related to both angiogenesis and inflammation in rheumatoid arthritis[J]．Clin Exp Rheumatol, 2009,27(6):945-951．

[11]黃嫻倩,陳勇,龔麗敏,等．類風濕關節(jié)炎患者血清缺氧誘導因子-1α的檢測及與關節(jié)滑膜病變的相關性[J]．浙江醫(yī)學,2011,33(10): 1420-1422．

[12]Ozgonenel L,Cetin E,Tutun S,et al．The relation of serum vascular endothelial growth factor level with disease duration and activity in patients with rheumatoid arthritis[J]．Clin Rheumatol, 2010,29(5):473-477．

[13]Shankar J,Thippegowda P B,Kanum S A．Inhibition of HIF-1alpha activity by BP-1 ameliorates adjuvant induced arthritis in rats[J]．Biochem Biophys Res Commun,2009,387(2):223-228．

[14]Chou L W,Wang J,Chang P L,et al．Hyaluronan modulates accumulation of hypoxia-inducible factor-1 alpha,inducible nitric oxide synthase,and matrix metalloproteinase-3 in the synovium of rat adjuvant-induced arthritis model[J]．Arthritis Res Ther, 2011,13(3):R90．

Effects of shRNA-HIF-1α-mediated gene silencing on VEGF expression and proliferation of fibroblast-like synoviocytes in patients with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the effects of shRNA-HIF-1α-mediated gene silencing on VEGF expression and proliferation of fibroblast-like synoviocytes (FLS)in patients with rheumatoid arthritis in vitro．MethodsThe fibroblast-like synoviocytes were isolated and cultured from synovial tissue of 9 patients with rheumatoid arthritis．The cultured FLSs were divided into 4 groups:hypoxic group,normoxic group,the negative control group (transfected with blank plasmids)and the positive group (transfected with HIF-1α-shRNA)．The cells in normoxic group were incubated under normoxia,and cells in other three groups were incubated under hypoxia．The expression of HIF-1α and VEGF protein and mRNA were detected by Western blot and qRT-PCR,respectively．The cells in hypoxia,negative control and positive groups were incubated under hypoxia for 6,12,24 and 48 hours．The proliferation of RA-FLS was examined by MTT．ResultsHigher expressions of HIF-1α and VEGF protein and mRNA were detected in hypoxic group compared with those in normoxia group (P＜0．05)．There were no significant differences in protein and mRNA expression of HIF-1α and VEGF between normoxic group and negative control group (P＞0．05)．Compared with the normoxic group and the negative control group,the expression of HIF-1α and VEGF protein and mRNA in positive group were significantly lower(P＜0．05)．The expression of HIF-1α were positively correlated with VEGF in all 4 groups (P＜0．05)．MTT assays showed that the FLS proliferation in positive group were slower than that in normoxic and negative control groups(P＜0．05)．ConclusionThe plasmids of HIF-1α-shRNA can inhibit HIF-1α and VEGF expression and cell proliferationsof fibroblast-like synoviocytes in patients with rheumatoid arthritis．

Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocytes RNA interfering Cell proliferation Hypoxia-inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2014-03-17）

（本文編輯：嚴瑋雯）

寧波市社會發(fā)展科研項目基金資助（2012C50010）；寧波市自然基金項目（2013A610259）

315010 寧波市第二醫(yī)院風濕免疫科（陳勇、彭勇、于靜雅、鄔秀娣、張振、干敏芝、黃嫻倩、章海均）；寧波市第六醫(yī)院風濕免疫科（羅晶）

陳勇，E-mail：nbdeyycy@163.com