朱錦，孫建輝，白江濤，羅光華

（常州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇常州213003）

江蘇地區(qū)漢族人群冠心病患者肝X受體基因-6A多態(tài)性

朱錦，孫建輝，白江濤，羅光華

（常州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇常州213003）

目的：探討江蘇地區(qū)冠心病患者肝X受體（liver X receptor，LXR）基因-6A（rs11039155）多態(tài)性位點與冠心病遺傳易感性的關(guān)系。方法：選取江蘇地區(qū)冠心病患者165例，健康體檢者191例作為對照。采用單熒光標(biāo)記探針技術(shù)檢測LXR-6A基因型。同時測定兩組樣本三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖等生化指標(biāo)。結(jié)果：LXR-6A（rs11039155）僅檢出一種基因型，與探針完全匹配，出現(xiàn)一個融解峰，Tm值55．21℃。隨機抽取22例樣本進行測序，提示基因型為GG純合子。結(jié)論：江蘇地區(qū)漢族人群不存在LXR-6A（rs11039155）單核苷酸多態(tài)性位點。

肝X受體；基因；冠心?。欢鄳B(tài)性；漢族

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是一類多因素疾病，遺傳因素及環(huán)境影響決定了疾病的發(fā)生及發(fā)展過程?，F(xiàn)代觀念認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板反應(yīng)、脂質(zhì)浸潤、動脈平滑肌細(xì)胞增殖和結(jié)締組織合成增加為主要病理過程。冠心病的危險因素包括高血壓、脂質(zhì)代謝異常、糖尿病和糖耐量異常、吸煙等。其中血膽固醇升高，尤其是血LDL-C升高為獨立危險因素。

肝X受體α（liver X receptorα，LXRα）是一類核受體家族成員，主要分布于肝臟、脂肪組織、腎、脾、小腸和巨噬細(xì)胞，由定位于11號染色體短臂（11p11．2）的基因編碼［1］。內(nèi)生性配體為氧化甾醇和膽固醇生物合成途徑的中間產(chǎn)物。肝X受體必須與視黃醇X受體結(jié)合形成異二聚體作用于靶基因，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要生理功能為控制膽固醇內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，脂蛋白代謝及脂肪合成［2］。研究發(fā)現(xiàn)，肝X受體信號通路在動脈粥樣硬化發(fā)展中起重要作用。在小鼠模型中，合成的肝X受體激動劑可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展，其效應(yīng)可能是源于對相關(guān)代謝和炎癥基因表達(dá)的調(diào)控［3］。

肝X受體α在膽固醇代謝及動脈粥樣硬化過程中的重要作用提示其與冠心病可能存在一定關(guān)聯(lián)。而目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于該基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性的研究。本課題通過病例與健康者的對照研究，從分子遺傳學(xué)角度探討LXRα基因位點-6A多態(tài)性在江蘇地區(qū)漢族人群中分布情況及在冠心病發(fā)病過程中的可能作用。

1 對象與方法

1．1 對象

冠心病組165例為2005年8月至2008年6月本院心內(nèi)科住院的冠心病患者，男133例，女32例，平均年齡（61．96±9．93）歲。全部冠心病病例均依據(jù)1979年WHO頒布的缺血性心肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，以冠狀動脈造影各主要分支存在≥50%狹窄定義為有意義病變。部分患者已接受他汀類藥物降血脂治療。對照組191例為健康體檢者，男150例，女41例，平均年齡（60．90±9．48）歲。經(jīng)詢問病史、體格檢查、實驗室常規(guī)生化檢查、心電圖檢查等初步排除冠心病、高血壓、糖尿病。選取病例均為無近親血緣關(guān)系的江蘇地區(qū)漢族人。

1．2 方法

1．2．1 觀察指標(biāo) 一般情況、既往疾病史、疾病家族史、吸煙飲酒史，晨起測體質(zhì)量、身高、血壓?？崭?2 h取靜脈血2 mL，生化分析儀檢測三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖等生化指標(biāo)。

1．2．2 外周血白細(xì)胞DNA的制備 取EDTA抗凝靜脈血100μL，用UIIQ-10柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，TE緩沖液溶解保存于－20℃冰箱中。

1．2．3 主要儀器與試劑 Roche公司LightCycler（版本號3．5）基因擴增檢測儀，Taq DNA聚合酶，4×dNTPs，10×緩沖液以及MgCl2等。LXR-6A的引物序列上游：5′-GGCTTACTCCAATAATCCCCACACTT-3′，下游：5′-AAGGAAGAAGGCAGGTAATGATGAAGGAG-3′。

1．2．4 LXRα基因-6A位點基因型檢測 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），并根據(jù)堿基淬滅探針技術(shù)設(shè)計單熒光探針檢測單核苷酸多態(tài)性［4］。PCR反應(yīng)在Roche公司LightCycler基因擴增檢測儀上進行。隨機抽取10%的樣本進行2次基因型分析。

1．3 方法學(xué)比較

隨機選取PCR擴增后樣本送上海申友公司進行測序，并比對測序結(jié)果。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。兩組均數(shù)比較采用t檢驗。直接計數(shù)法計算冠心病組及對照組基因型和等位基因頻率分布。用Kappa檢驗對堿基淬滅探針技術(shù)與DNA測序計數(shù)的檢驗結(jié)果進行一致性檢驗。

2 結(jié)果

2．1 兩組一般臨床資料比較

對照組與冠心病組之間年齡、男女構(gòu)成比、空腹血糖之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。對照組總膽固醇、HDL-C、LDL-C明顯高于冠心病組（P＜0．05），而冠心病組三酰甘油明顯高于對照組。見表1。

2．2 基因分型

LXR-6A（rs11039155）選自美國國家生物技術(shù)情報中心dbSNP數(shù)據(jù)庫（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/sites/entrez），位于5′UTR?？僧a(chǎn)生3種基因型，分別為GG、AA和GA。本實驗特異性擴增出長度447 bp的LXRα基因片段。擴增產(chǎn)物通過特異性的單熒光探針進行檢測。冠心病組165例中僅檢出GG基因型，對照組191例也僅檢出GG純合子。兩組合計356例，均未檢出AA純合子及GA雜合子。與探針完全匹配，僅一個Tm值55．21℃，出現(xiàn)一個融解峰（圖1）。

2．3 LXR-6A測序結(jié)果

隨機選取22例樣本進行測序，其中，冠心病組9例，對照組13例，結(jié)果提示該位點基因型均為GG型。測序結(jié)果如圖2。

2．4 方法學(xué)比較

堿基淬滅探針技術(shù)與DNA測序結(jié)果比較，一致性Kappa檢驗顯示2種單核苷酸多態(tài)性檢驗結(jié)果一致（Kappa＝1，P＝0．000）。見表2。

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率大于1%，是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上［5］。SNPs數(shù)量大，分布廣，在不同人群中的分布頻率也有差異，這些差異可以代表某一種族或人群的遺傳差異。本研究中，LXR-6A（rs11039155）位點在中國漢族人群356例樣本中，僅見一種基因型，即GG純合子，未見AA純合子及GA雜合子，A的等位基因頻率遠(yuǎn)小于1%，提示江蘇地區(qū)漢族人群中不存在該SNPs位點。美國國家生物技術(shù)情報中心（NCBI）的dbSNP數(shù)據(jù)庫中未見LXR-6A（rs11039155）位點的種族分布報道。Legry等［6］報道，法國人群2 290例樣本中，GG純合子1 799例，GA雜合子461例，AA純合子30例，構(gòu)成比分別為78．56%，20．13%，1．31%，G、A等位基因頻率分別為88．62%，11．38%。對于現(xiàn)有已公開的SNPs數(shù)據(jù)庫分析研究后，我們發(fā)現(xiàn)，歐洲人的樣本中包含了80%的SNPs，而非洲裔美國人樣本則僅有50%的SNPs［7］。這些結(jié)果提示SNPs存在人種分布的差異性，本研究也驗證了這一可能結(jié)果。研究者將頻率較高的基因型稱為祖先型［8］。本研究中位點G為祖先型。從人類起源及基因變異的角度看，A的產(chǎn)生可能是人類在進化過程中的基因漂移及自然選擇的結(jié)果，法國人群中的這一位點由G突變成A并進化形成SNPs，而江蘇地區(qū)漢族人群LXR-6A（rs11039155）并沒有形成SNPs。

LXR信號通路參與機體的脂質(zhì)代謝，肝X受體激動劑還可通過抑制活性氧生成和AMP活化的蛋白激酶激活緩解高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙［9］。而脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮功能障礙均是冠心病的發(fā)病機制之一。Legry等［6］研究還發(fā)現(xiàn)，LXR-6A位點可降低30%患代謝綜合征的危險（校正OR＝0．68，95%CI：0．53～0．86，P＝0．001），同時LXR-6A與升高血HDL-C水平相關(guān)（P＝0．02）?，F(xiàn)在認(rèn)為代謝綜合征為冠心病的等危癥。HELENA研究發(fā)現(xiàn)LXR及其靶基因ABCA1、apoE、CEPT、LPL基因多態(tài)性與青少年時期血清HDL-C濃度存在關(guān)聯(lián)［10］。弗明漢心臟研究（Framingham Heart Study）發(fā)現(xiàn)血HDL-C水平每升高1 mg／dL，可降低女性心血管疾病發(fā)病率3%，降低男性心血管疾病發(fā)病率2%［11］。一項日本人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血HDLC水平較低，可顯著獨立增加缺血性腦卒中的發(fā)病率。攜帶LXR-6A對于冠心病、代謝綜合征及缺血性腦卒中等具有協(xié)同保護作用［12］。而中國漢族人群缺乏LXR-6A，從而可能缺乏這一保護因素。

本研究結(jié)果表明在漢族人群中不存在LXR-6A（rs11039155）這一SNPs位點，為進一步理解冠心病及代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制及防治提供了新的線索。同時也為人類基因組多樣性計劃（Human Genome Diversity Project）dbSNP提供了相關(guān)位點新的人種分布信息。但是本研究選取樣本量為356例，且多為江蘇地區(qū)人群，樣本量偏小，人群范圍較局限，還有待于大規(guī)模、多中心的大樣本研究進一步確證。

［1］ Willy PJ，Umesono K，Ong ES，et al．LXR，a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway［J］．Genes Dev，1995，9（9）：1033－1045．

［2］ Wojcicka G，Jamroz-Wisniewska A，Horoszewicz K，et al．Liver X receptors（LXRs）．PartⅠ：structure， function，regulation of activity，and role in lipid metabolism［J］．Postepy Hig Med Dosw（Online），2007，61：736－759．

［3］ Joseph SB，McKilligin E，Pei L，et al．Synthetic LXR ligand inhibits the developmentofatherosclerosis inmice［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2002，99（11）：7604－7609．

［4］ Luo G，Zheng L，Zhang X，et al．Genotyping of single nucleotide polymorphisms using base-quenched probe：a method does not invariably depend on the deoxyguanosine nucleotide［J］．Anal Biochem，2009，386（2）：161－166．

［5］ Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A．A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation［J］．Genome Res，1998，8（12）：1229－1231．

［6］ Legry V，Cottel D，F(xiàn)errieres J，et al．Association between liver X receptorαgene polymorphisms and risk of metabolic syndrome in French populations［J］．Int J Obes（Lond），2008，32（3）：421－428．

［7］ Carlson CS，Eberle MA，Rieder MJ，et al．Additional SNPs and linkage-disequilibrium analyses are necessary forwhole-genome association studies in humans［J］．Nat Genet，2003，33（4）：518－521．

［8］ Bamshad MJ，Wooding S，Watkins WS，et al．Human population genetic structure and inference of group membership［J］．Am J Hum Genet，2003，72（3）：578－589．

［9］ Li X，Song Y，Han Y，et al．Liver X receptor agonist alleviated high glucose-induced endothelial progenitor cell dysfunction via inhibition of reactive oxygen species and activation of AMP-activated protein kinase［J］．Microcirculation，2012，19（6）：547－553．

［10］ Legry V，Bokor S，Beghin L，et al．Associations between common genetic polymorphisms in the liver X receptorαand its target genes with the serum HDL-cholesterol concentration in adolescents of the HELENA Study［J］．Atherosclerosis，2011，216（1）：166－169．

［11］ Asztalos BF，Cupples LA，Demissie S，et al．High-density lipoprotein subpopulation profile and coronary heart disease prevalence in male participants of the Framingham Offspring Study［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（11）：2181－2187．

［12］ Soyama Y，Miura K，Morikawa Y，et al．High-density lipoprotein cholesteroland risk of stroke in Japanesemen and women：the Oyabe Study［J］．Stroke，2003，34（4）：863－868．

Liver X receptorαgene polymorphism s（-6A）of the patients w ith coronary heart disease in Han population in Jiangsu province

ZHU Jin，SUN Jian-hui，BAIJiang-tao，LUO Guang-hua
（Department of Cardiology，the First People′s Hospital of Changzhou，Changzhou Jiangsu 213003，China）

Objective：To investigate the relation between-115A（rs12221497）and-6A（rs11039155）pointmutation of liver X receptorαand the patientswith coronary heart disease（CHD）．M ethods：The-6A polymorphism in the liver X receptorαgenewere detected by using single-labeled probe technique．Plasma cholesterol，triglyceride，HDL-cholesterol，LDL-cholesterol，fasting blood glucose（FBG）were determined in 165 patients with CHD and 191 normal controls．Results：LXR-6A（rs11039155）had only one genetype．Randomly selected 22 cases of samples for gene sequencing，suggesting：genetypes of GG homozygote．Conclusion：There was nomutation in liver X receptorαgene-6A point in Han population in Jiangsu province．

liver X receptor；gene；coronary heart disease；polymorphism；the Han nationality

R543．3

A

1671－7783（2014）05－0412－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140145

朱錦（1980—），男，江蘇高郵人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事冠心病的基礎(chǔ)與臨床研究；孫建輝（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：sunjianh＠sohu．com

2014－05－28 ［編輯］何承志