郭紅玲，徐風(fēng)娟，茅彩萍，莊燕燕，夏飛

（1．太倉市第一人民醫(yī)院婦科，江蘇太倉215400；2．蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇蘇州215006）

原因不明自然流產(chǎn)中芳香烴受體與Treg／Th17細(xì)胞因子平衡的關(guān)系

郭紅玲1，徐風(fēng)娟1，茅彩萍2，莊燕燕2，夏飛2

（1．太倉市第一人民醫(yī)院婦科，江蘇太倉215400；2．蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇蘇州215006）

目的：檢測芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）在原因不明自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)與蛻膜中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）／Th17細(xì)胞因子平衡之間的關(guān)系。方法：選擇原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者23例作為觀察組，另選擇正常早孕婦女30例作為對(duì)照組；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測兩組蛻膜組織中AhR、叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box p3，F(xiàn)oxp3）、IL-10及維甲酸孤獨(dú)核受體γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）等mRNA表達(dá)，并對(duì)AhRmRNA表達(dá)與Foxp3、IL-10、ROR-γmRNA表達(dá)作相關(guān)分析。結(jié)果：觀察組蛻膜中AhRmRNA、ROR-γmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，但Foxp3 mRNA、IL-10 mRNA則明顯低于對(duì)照組（P均＜0．05）。兩組蛻膜中AhRmRNA表達(dá)與ROR-γmRNA表達(dá)呈正相關(guān)（P均＜0．05），與Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表達(dá)則無明顯相關(guān)性（P均＞0．05）。結(jié)論：原因不明自然流產(chǎn)患者蛻膜中AhRmRNA及Th17細(xì)胞因子表達(dá)均升高，而Treg細(xì)胞因子表達(dá)下降，Treg／Th17細(xì)胞比例下降。AhR表達(dá)增高與Th17細(xì)胞因子上調(diào)相關(guān)。

自然流產(chǎn)；芳香烴受體；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Th17

自然流產(chǎn)病因復(fù)雜，機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，正常妊娠的維持依賴于母體對(duì)胎兒建立的局部免疫耐受環(huán)境，對(duì)父方來源的胎兒組織發(fā)生免疫識(shí)別和產(chǎn)生免疫反應(yīng)。母方來源的免疫細(xì)胞、胎兒來源的絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞匯集于母胎界面［1］，這些細(xì)胞通過表達(dá)表面分子建立母胎之間的信息傳遞網(wǎng)絡(luò)，從而形成耐受妊娠的免疫微環(huán)境，有利于正常妊娠的維持。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）是調(diào)控母胎界面局部免疫耐受形成的重要因素，對(duì)正常免疫耐受和妊娠的維持起重要作用。Treg為CD4＋CD25＋T細(xì)胞，具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能，其分泌的細(xì)胞因子主要有IL-10、TGF-β等。叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box p3，F(xiàn)oxp3）為Treg細(xì)胞標(biāo)記分子，反映其活性水平［2］。研究發(fā)現(xiàn)［3］，在小鼠孕早期轉(zhuǎn)移體外擴(kuò)增的Treg能夠保護(hù)胚胎避免自然流產(chǎn)。Th17細(xì)胞是一類以高分泌IL-17為特征的CD4＋T細(xì)胞，維甲酸孤獨(dú)核受體γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）為其特異性調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)［4］，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血Th17細(xì)胞明顯增多。

許多研究發(fā)現(xiàn)，母胎界面Treg／Th17平衡失調(diào)是引起原因不明自然流產(chǎn)的重要原因。有報(bào)道稱［5］，與健康妊娠者相比，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中CD4＋CD25brightFoxp3＋Treg細(xì)胞減少，Th17細(xì)胞增加，Th17／Treg比率明顯增高。Lee等［4］研究也發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)非妊娠女性中IL-17＋T細(xì)胞（包括Th17和Tc17細(xì)胞）明顯高于對(duì)照組，而Foxp3＋，F(xiàn)oxp3low和CD4＋Foxp3＋T細(xì)胞明顯降低。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，以配體依賴的方式調(diào)節(jié)Treg／Th17的平衡［6］。AhR高親和力配體主要為環(huán)境毒素四氯二苯對(duì)二噁英（2，3，7，8-etrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）以及內(nèi)源性色氨酸衍生物6-甲?；胚岵⑦沁颍?-formylindolo［3，2－b］carbazole，F(xiàn)ICZ）。當(dāng)前者激活初始T細(xì)胞中AhR時(shí)，T細(xì)胞向Treg分化；而當(dāng)后者激活A(yù)hR時(shí)，初始T細(xì)胞則向Th17分化。AhR在病理妊娠過程中是否發(fā)揮作用尚缺乏研究，因此，本研究將分別檢測AhR在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和正常早孕者蛻膜組織中的表達(dá)情況，并分析其與蛻膜中Treg／Th17細(xì)胞因子平衡的相關(guān)性，從而初步探討其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的作用。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象

選擇2013年1月至9月就診于我院婦產(chǎn)科門診及婦科病房，＜35歲的原因不明自然流產(chǎn)患者23例，作為觀察組。其中，16例發(fā)生過1次自然流產(chǎn)，7例發(fā)生過2次自然流產(chǎn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：男方精液分析正常；月經(jīng)周期正常，通過婦科檢查、白帶檢查以及超聲檢查等排除器質(zhì)性疾病、生殖器官畸形及感染性因素；夫婦雙方無家族遺傳病及近親結(jié)婚史；無自身免疫性疾??；自身抗體檢查：抗核抗體系列、抗卵巢總抗體、抗子宮內(nèi)膜總抗體，抗心磷脂抗體、抗精子總抗體、抗雙鏈DNA、抗中性粒細(xì)胞質(zhì)抗體均為陰性；以往未進(jìn)行過相關(guān)免疫治療；無內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病；凝血系列、全血分析均正常。

另選擇同時(shí)期在我院婦產(chǎn)科門診手術(shù)室行人流術(shù)的健康早孕婦女30例，作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：＜35歲，妊娠12周以內(nèi)要求人工流產(chǎn)的健康妊娠婦女；本次妊娠期間無先兆流產(chǎn)癥狀和體征；超聲證實(shí)胚胎發(fā)育正常；既往無解剖異常、遺傳性疾病、內(nèi)分泌疾病史，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，無生殖道感染，無自身免疫性疾病史。

兩組年齡與孕周間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意。

1．2 方法

1．2．1 標(biāo)本收集 無菌操作條件下分別收集兩組蛻膜組織，PBS漂洗后剪取約100 mg，置于DEPC處理過的EP管中，加入1 mL Trizol試劑，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測mRNA表達(dá) 取出“1．2．1”中的組織，待溶解后，用組織勻漿儀粉碎，Trizol法提取總RNA；Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定RNA濃度，加入DEPC調(diào)節(jié)各樣本RNA濃度為500μg／μL備用。用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于－20℃保存?zhèn)溆?。用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照Bestar Real-time PCR Master Mix（DBIBioscience，USA）說明書配制反應(yīng)體系，置入ABIViia7（Applied Biosystems，USA）PCR儀中反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，然后95℃15 s，60℃31 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用單克隆大腸埃希菌分別稀釋100、1 000、10 000、100 000倍后作為模板配置上述體系后行PCR，用所得Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝a Ct＋b，計(jì)算a、b值，分別將各樣本所測Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)Y值，依據(jù)Y值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（△t）：△t＝Y(jié)（檢測基因）－Y（GAPDH），檢測基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2－△t。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料符合正態(tài)性分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r＞0．5時(shí)為相關(guān)性良好。

2 結(jié)果

2．1 兩組蛻膜中各因子mRNA的表達(dá)

觀察組蛻膜中AhR、ROR-γmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而Foxp3、IL-10 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P均＜0．05）。見表2。

2．2 兩組蛻膜中各因子表達(dá)量的相關(guān)性比較

觀察組和對(duì)照組蛻膜中AhR mRNA表達(dá)與ROR-γmRNA表達(dá)均呈正相關(guān)（P均＜0．05），而與Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表達(dá)均無明顯相關(guān)性（P均＞0．05）。見圖1。

3 討論

AhR又稱二噁英受體，體內(nèi)表達(dá)水平較低［7－8］，但分布較為廣泛，在肺、肝、腎、胎盤、扁桃體等組織及B淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)。AhR通過介導(dǎo)多環(huán)芳烴類的毒性作用，參與某些重要的生物學(xué)過程［7，9－10］。AhR與不同配體結(jié)合后影響細(xì)胞的不同功能，并進(jìn)一步影響Treg／Th17平衡［11－12］，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)。

AhR表達(dá)于母胎界面、孕早期胚胎、蛻膜組織和孕前子宮內(nèi)膜［13］，正常足月分娩胎盤的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，觀察組蛻膜組織中AhR表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示AhR高表達(dá)可能與原因不明自然流產(chǎn)之間存在聯(lián)系。AhR配體可在生殖道和胚胎中聚集，從而增強(qiáng)局部AhR的表達(dá)，進(jìn)而參與各種生理病理過程。本研究中AhR在原因不明自然流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)增高，致使部分具有胚胎毒性的AhR配體發(fā)揮更強(qiáng)的作用，影響蛻膜的免疫平衡及胚胎發(fā)育，導(dǎo)致病理妊娠。

本研究結(jié)果還顯示，觀察組患者蛻膜中Treg因子Foxp3、IL-10的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而Th17細(xì)胞因子ROR-γ的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。不同T細(xì)胞中AhR表達(dá)也不同［14－15］，Treg中AhR表達(dá)遠(yuǎn)低于Th17細(xì)胞。因此，本文觀察組AhR表達(dá)增高可能是由于Th17細(xì)胞表達(dá)增加所致。此外，本研究結(jié)果顯示，AhR表達(dá)與ROR-γ表達(dá)呈良好的正相關(guān)，由此表明，檢測AhR表達(dá)水平可間接反映Th17水平，從而評(píng)估胚胎存活可能；同時(shí)，可通過改變AhR水平治療部分免疫因素的自然流產(chǎn)。但是，AhR與Treg的細(xì)胞因子Foxp3和IL-10無明顯相關(guān)性，可能由于Treg中AhR表達(dá)過低，由此可見，AhR難以用于反應(yīng)Treg的表達(dá)水平。因此，推測AhR可能參與Th17的表達(dá)上調(diào)，干擾Treg／Th17平衡，進(jìn)而在母胎面免疫調(diào)節(jié)中起作用，并影響妊娠結(jié)局。復(fù)發(fā)流產(chǎn)患者AhR表達(dá)增加是導(dǎo)致Th17上調(diào)的原因，還是Th17表達(dá)增加后的一個(gè)協(xié)同表現(xiàn)，目前尚有待進(jìn)一步研究。

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Relationship between aryl hydrocarbon receptor and the balance of Treg／Th17 cytokines in unexplained spontaneous abortion

GUO Hong-ling1，XU Fen-juan1，MAO Cai-ping2，ZHUANG Yan-yan2，XIA Fei2
（1．DepartmentofGynaecology，the First People′s Hospital of TaiCang，Taicang Jiangsu 215400；2．Departmentof Reproductive Medicine，the First Affiliated Hospital of Suzhou University，Suzhou Jiangsu 215006，China）

Objective：To investigate the expression of aryl hydrocarbon receptor（AhR）in decidua of unexplained spontaneous abortion，and explore the correlation with T regulatory cell（Treg）／Th17 cytokines balance of decidua．M ethods：Twenty-three unexplained recurrent spontaneous abortion women were set as the abortion group，while 30 normal early pregnantwomen as the control group．Quantitative real-time PCR were employed to detect the expression of AhR，forkhead box p3（Foxp3），IL-10 and retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ（ROR-γ）mRNA in decidua．The correlation of AhR mRNA with Foxp3，IL-10，ROR-γmRNA were analyzed．Results：The expression of AhR mRNA and ROR-γmRNA in decidua in abortion group was significantly higher than that in control group，while Foxp3 mRNA and IL-10 mRNA expression was significantly lower than the control group（both P＜0．05）．AhRmRNA expression was positively correlated with the level of ROR-γmRNA in two groups（P＜0．05）．However，AhR mRNA expression was not correlated with Foxp3 nor IL-10 mRNA expression in both two groups（both P＞0．05）．Conclusion：In decidua of unexplained spontaneous abortion，Th17 cytokines expression and AhR mRNA expression was increased，with Treg cytokines expression and the ratio of Treg／Th17 decreased，which indicated increasing AhR expression positively correlated with up-regulating Th17 cytokines．

spontaneous abortion；aryl hydrocarbon receptor；T regulatory cell；Th17

郭紅玲（1968—），女，江蘇揚(yáng)州人，主任醫(yī)師，碩士，主要從事復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究；夏飛（通訊作者），主任醫(yī)師，副教授，E-mail：feix0513＠126．com

R714．21

A

1671－7783（2014）05－0416－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140111

江蘇省衛(wèi)生廳課題資助項(xiàng)目（H201311）；蘇州市臨床重點(diǎn)病種診療技術(shù)專項(xiàng)項(xiàng)目（LCZX201302）

2014－04－21 ［編輯］ 劉星星