王旭昀 李海松 張宏 黨進(jìn)

右歸丸是張景岳根據(jù)《難經(jīng)》“陰中求陽(yáng)”的理論所創(chuàng)，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)，填精補(bǔ)血的作用，右歸膠囊是在右歸丸基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的一種新劑型，藥物成分、適應(yīng)癥和右歸丸完全相同，對(duì)腎陽(yáng)不足、腎精虧虛癥所導(dǎo)致的不育有較好的臨床療效。目前尚未有實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)右歸膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛男性不育癥的治療作用。本實(shí)驗(yàn)從大鼠生殖性腺的重量及組織形態(tài)學(xué)變化兩方面觀察了右歸膠囊對(duì)腺嘌呤致腎陽(yáng)虛不育模型大鼠生殖功能的影響，探討其治療男性不育癥的機(jī)制所在，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠45 只，育齡3 個(gè)月左右，清潔級(jí)，體重(300±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，公司許可證號(hào):SCXK(京)2006-0009，批號(hào):20090316。大鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科技發(fā)展中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，合格證號(hào):SYXK(京)2006-0012。清潔飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司供給。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

右歸膠囊:由江西銀濤藥業(yè)有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030134，生產(chǎn)批號(hào):1002005);腺嘌呤(Adenine):由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào)20090107);上述藥品臨用前混懸于0.5%的羧甲基纖維素(caboxy methyl cellulose，CMC)中灌胃;羧甲基纖維素鈉:由北京化學(xué)試劑有限責(zé)任公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào):3405005)氯化鉀、果糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、Bouins 液、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、氯化鈉等，均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DL-8R 冷凍離心機(jī):深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;細(xì)胞計(jì)數(shù)器:上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠;Olympus BX60 熒光顯微鏡:日本產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及給藥方法

購(gòu)入3 個(gè)月齡左右SD 雄性大鼠45 只，將大鼠置于清潔級(jí)動(dòng)物室中，動(dòng)物室室溫28℃、濕度65%，自由進(jìn)食飲水適應(yīng)1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、右歸組，每組15 只。正常組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉(10 ml/kg)灌胃，4小時(shí)后給予10 ml/kg 的蒸餾水灌胃;模型組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉(10 ml/kg)灌胃，4 小時(shí)后0.5%羧甲基纖維素鈉配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg);右歸組常規(guī)喂養(yǎng)，0.5%羧甲基纖維素鈉配置的“右歸膠囊”(10 ml/kg)、每ml 含右歸膠囊154.3 mg(1543 mg/kg)灌胃(人體用量的20 倍);4 小時(shí)后用0.5%羧甲基纖維素鈉配制后的腺嘌呤(10 ml/kg)灌胃(每ml 含腺嘌呤25 mg)。以上操作每日1 次，共30 天。實(shí)驗(yàn)期間每5天稱(chēng)體重1 次，調(diào)整給藥量。給藥量按人和動(dòng)物體表面積計(jì)算公式計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)及取材過(guò)程中，正常組大鼠死亡4 只，模型組大鼠死亡5 只，右歸組大鼠死亡4 只，故三組最終有效例數(shù)分別是正常組11 只、模型組10 只、右歸組11 只。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理

給藥后第30 天將每組大鼠于末次給藥1 小時(shí)后在安靜狀態(tài)下用10%水合氯醛麻醉;取血后立即取出雙側(cè)睪丸、附睪、前列腺+精囊腺電子天平稱(chēng)重;右側(cè)睪丸用睪丸用Bouins 液(苦味酸飽和液75 ml、甲醛25 ml、冰醋酸5 ml 配制)固定，24 小時(shí)后脫水，包埋，制塊，切片5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組大鼠睪丸曲細(xì)精管形態(tài)及精子發(fā)生狀態(tài)。

2.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

2.3.1 組織重量測(cè)定 于末次給藥1 小時(shí)后處死大鼠，立即以YB 型電子天平測(cè)量大鼠睪丸、附睪、精囊腺的重量。

2.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 取出已固定的睪丸解剖標(biāo)本、睪丸矢狀斷面標(biāo)本，取組織緩沖液中后固定，按病理學(xué)常規(guī)方法脫水、透明、包埋、切片(5 μm厚)，蘇木素-伊紅(HE)染色;光鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)有無(wú)病變，同時(shí)觀察各組大鼠睪丸生精小管結(jié)構(gòu)、排列密度、曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)精原細(xì)胞數(shù)量、生精細(xì)胞排列層次及精子數(shù)量等組織結(jié)構(gòu)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用(±s)表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用LSD-t 法，P＜0.05 提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為保證檢測(cè)指標(biāo)的客觀真實(shí)性，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)剔除不符合正態(tài)分布原則的界外值。

3 結(jié)果

3.1 右歸膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛不育模型大鼠生殖器官重量的影響

以腺嘌呤混懸液為灌胃藥物，誘發(fā)腎陽(yáng)虛不育模型大鼠，經(jīng)右歸膠囊灌胃治療后，各組大鼠生殖器官重量存在著顯著的差異。右歸組大鼠左側(cè)睪丸、右側(cè)睪丸，左側(cè)附睪、右側(cè)附睪，前列腺+精囊重量均低于正常組大鼠但高于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。五組數(shù)據(jù)組間比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較均采用LSD-t 法，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 右歸膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛不育模型大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

3.2.1 肉眼觀察 正常組大鼠睪丸體積基本正常，表面光滑，可見(jiàn)血管走行;模型組大鼠睪丸體積明顯縮小;大部分右歸組大鼠睪丸體積恢復(fù)近至正常。

3.2.2 光鏡觀察睪丸組織病理學(xué)變化 正常組大鼠睪丸曲細(xì)精管排列規(guī)則整齊，各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育良好，數(shù)量正常，層次分明，管腔內(nèi)可見(jiàn)成熟精子，管壁邊界整齊，基膜薄，睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)正常，未見(jiàn)變性及壞死等病變(圖1A、B);模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管明顯萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，部分脫落，支持細(xì)胞相對(duì)增多，管腔內(nèi)精子明顯減少(圖1C、D)，曲細(xì)精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目亦明顯減少;右歸組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮明顯減輕，各級(jí)生精細(xì)胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組增多(圖1E、F)。由上可知，右歸組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮明顯減輕，各級(jí)生精細(xì)胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，表明右歸膠囊對(duì)腺嘌呤致腎陽(yáng)虛不育有較好的治療作用。

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及模型制備評(píng)價(jià)

SD 大鼠體型較大，適宜做生殖器官的損傷修復(fù)等實(shí)驗(yàn)，常用于計(jì)劃生育方面的研究。本實(shí)驗(yàn)為男性不育癥研究，動(dòng)物模型為生精細(xì)胞損傷，故在本實(shí)驗(yàn)中選擇3月齡SD 雄性大鼠為受試動(dòng)物。腺嘌呤誘發(fā)腎陽(yáng)虛不育模型大鼠，一方面可直接損傷睪丸使精子數(shù)目減少，另外一方面可直接或間接地引起大鼠其它生殖腺組織損傷、功能損害，從而導(dǎo)致精液質(zhì)量變差，已有相關(guān)文獻(xiàn)指出腺嘌呤灌胃或者喂養(yǎng)動(dòng)物能夠誘導(dǎo)理想的腎陽(yáng)虛睪丸功能損害模型［1］。此外，腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽(yáng)虛不育模型大鼠血清睪酮水平偏低，雌二醇偏高［2］，因此從形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及反映生殖系統(tǒng)改變的各項(xiàng)指標(biāo)上來(lái)看，腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽(yáng)虛不育模型最優(yōu)。

本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤灌胃復(fù)制腎陽(yáng)虛不育模型大鼠較為成功，具體表現(xiàn)如下:(1)睪丸病理切片發(fā)現(xiàn)模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管明顯萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，部分脫落，支持細(xì)胞相對(duì)增多，管腔內(nèi)精子明顯減少，曲細(xì)精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目亦明顯減少，表明不育模型的成功。(2)模型組大鼠大部分于給藥第十天出現(xiàn)擁擠在一起，萎靡不振、畏寒怕冷、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象;后逐漸出現(xiàn)皮毛無(wú)光澤、飲食減少、腹部皮毛、尾巴潮濕、耳廓蒼白、瞇眼、眼瞼周?chē)∧[、豎毛、多尿等類(lèi)似腎陽(yáng)虛的癥狀，且癥狀隨給藥日數(shù)增加而加劇，表明腎陽(yáng)虛模型的成功。

表1 各組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量的比較(±s)

表1 各組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量的比較(±s)

注:與正常組比較aP＜0.05，bP＜0.01;與模型組比較cP＜0.01

組別例數(shù) 右側(cè)睪丸重量(g) 左側(cè)睪丸重量(g) 右側(cè)附睪重量(g) 左側(cè)附睪重量(g) 精囊+前列腺重量(g)正常組 11 1.57±0.19 1.55±0.23 0.53±0.06 0.54±0.09 2.03±0.49模型組 10 0.90±0.27b 0.91±0.28b 0.31±0.11b 0.29±0.09b 0.46±0.13b右歸組 11 1.30±0.25ac 1.30±0.24ac 0.42±0.08bc 0.43±0.09bc 0.95±0.37 bc

圖1 各組給藥后第30 天大鼠睪丸組織HE 染色

4.2 右歸膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛不育模型大鼠生殖功能的影響及機(jī)制探討

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)右歸組大鼠睪丸、附睪、精囊腺+前列腺重量之和較模型組有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］。睪丸、附睪、精囊腺及前列腺的發(fā)育有賴(lài)于雄激素的支持，提示右歸膠囊有雄激素樣作用。

模型組大鼠睪丸病理切片示曲細(xì)精管明顯萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少、部分脫落，支持細(xì)胞相對(duì)增多，管腔內(nèi)精子明顯減少，曲細(xì)精管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目亦明顯減少;右歸組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮明顯減輕，各級(jí)生精細(xì)胞、精子數(shù)量及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組增多。表明右歸膠囊能有效防止腺嘌呤對(duì)曲細(xì)精管及各級(jí)生精細(xì)胞的損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4-5］。這可能是右歸膠囊治療腎陽(yáng)虛男子不育癥的一個(gè)機(jī)理所在，而右歸膠囊對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是其雄激素樣作用的機(jī)制所在。

總之，右歸膠囊可明顯提高大鼠睪丸、附睪、精囊腺、前列腺重量，特別是對(duì)附睪的影響，為精子的發(fā)生、成熟提供了較好的環(huán)境，是其治療男性不育癥的一個(gè)機(jī)制所在。右歸膠囊直接作用于睪丸曲細(xì)精管、保護(hù)生精細(xì)胞，促進(jìn)精子的發(fā)生和發(fā)育，亦是其治療男性不育癥的一個(gè)重要機(jī)制。

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