河北省任丘市衛(wèi)生學(xué)校 劉連臣 張睦清 杜志超（任丘 062550）

益胃祛瘀消痰方為經(jīng)多年臨床篩選出的治療慢性萎縮性胃炎 （CAG）的經(jīng)驗方，具有益氣養(yǎng)陰，祛瘀消痰之功，臨床用于治療CAG具有較好的療效。本研究采用流式細(xì)胞術(shù) （FCM）觀察了益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細(xì)胞凋亡與增殖及其相關(guān)調(diào)控基因Caspase3、Bcl－2和Fas基因蛋白表達(dá)的影響，以研究益胃祛瘀消痰方在治療CAG方面的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠，60只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，購自河北省實驗動物中心 （合格證號:冀動字1001005）。

1.2 藥物和試劑 益胃祛瘀消痰方藥物組成:黃芪、丹參、麥冬、炒白芍、炒白術(shù)、炙甘草、清半夏、黃連、丁香、陳皮等，采用水煎和醇提相結(jié)合方法，將提取液分別濃縮為含生藥0.367 g/mL、0.183 g/mL濃度的水溶液。三九胃泰膠囊和維霉素片均用蒸餾水制成0.1 g/mL濃度的混懸液。脫氧膽酸鈉購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。Fas、Bcl－2和Caspase3一抗單克隆抗體、二抗工作液（羊抗鼠PITC－IgG熒光抗體）均由美國Santa Cruz公司提供。

1.3 主要儀器 Epics－XLⅡ型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動物分組與造模 將實驗大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、維霉素組、三九胃泰組、益胃祛瘀消痰方低劑量組、益胃祛瘀消痰方高劑量組，共計6組。動物造模參照相關(guān)文獻(xiàn)采用的方法［1］即:先灌飼0.2%的脫氧膽酸鈉溶液，用量為每只1.5 mL/d，5 h以后，再灌飼50℃的熱水，用量為每只2 mL/d，同時加用饑飽失常的喂養(yǎng)方法，（2 d足量喂食，1 d停食），正常組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，每天灌飼等量的蒸餾水，造模時間共8周。

2.2 給藥方法 造模成功后，開始灌胃治療，其中，益胃祛瘀消痰方低劑量組和高劑量組分別按照1.83 g/kg、3.67 g/kg的劑量灌胃，維霉素組和三九胃泰組均按照1g/kg的劑量灌胃，正常組和模型組均給予等劑量的蒸餾水灌胃;1次/d，用藥體積均按照1 mL/100 g計算。

2.3 胃組織樣本制作 治療5周后，麻醉實驗大鼠，股動脈取血后，迅速剖開腹部，分離胃組織，沿胃竇近幽門口至胃大彎方向取適量的胃組織，于生理鹽水中沖洗后，以70%乙醇溶液固定，置于冰箱中冷藏待檢。

2.3.1 制備單細(xì)胞懸液:將固定的胃組織放置于100目的不銹鋼網(wǎng)上，網(wǎng)下置一平皿，用剪刀剪碎至1 mm3大小，再用眼科鑷子輕搓組織塊，邊搓邊以PBS液沖洗，直至將組織搓完。然后將平皿中的混懸液，用300目篩網(wǎng)過濾以去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，500～800 r/min離心2 min，棄去上清，保留沉淀，加入PBS 0.3 mL，稀釋混勻后，將單細(xì)胞懸液分成4份，調(diào)整每份的細(xì)胞數(shù)為1×106，分別用于檢測細(xì)胞凋亡、Caspase3、Bcl－2和Fas蛋白表達(dá)。

2.3.2 細(xì)胞凋亡DNA含量染色:取1×106細(xì)胞懸液0.1 mL，加入10%雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，加入碘化丙啶 （PI）1 mL，在4℃冰箱染色30 min，以500目銅網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測。

2.3.3 Bcl－2、Caspase3、Fas蛋白免疫熒光標(biāo)記:將鼠抗人單克隆抗體工作液0.1 mL，加入到單細(xì)胞懸液1×106/mL中，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL洗滌1次，棄去上清液，加入羊抗鼠PITC－IgG二抗工作液100μL，室溫孵育30 min，加入PBS 10 mL離心，棄去上清，除去未結(jié)合的熒光二抗，再加入PBS 0.1 mL并用500目的銅網(wǎng)過濾后，即可上機(jī)檢測。在對蛋白免疫熒光標(biāo)記物測定時，設(shè)一抗或二抗的本底作為對照和陰性對照。

2.3.4 檢測方法:采用Epics－XLⅡ型流式細(xì)胞儀，檢測前以 flow－checkTMFluorpheres（10μm）熒光微球作為標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。

2.4 測量資料分析方法 應(yīng)用MuticycleAV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬合分析，應(yīng)用Expo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，以細(xì)胞凋亡指數(shù) （AI）表示細(xì)胞凋亡程度，細(xì)胞增值指數(shù) （PI）代表細(xì)胞的增值活性，免疫熒光指數(shù) （FI）表示蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細(xì)胞凋亡的影響 模型組與正常組比較，胃組織細(xì)胞AI值、G0/G1期細(xì)胞百分率均明顯升高 （P＜0.01）;PI值和 G2/M期以及 S期細(xì)胞百分率降低 （P＜0.05）。經(jīng)藥物治療后，與模型組相比，各治療組G0/G1期細(xì)胞百分率和AI值均明顯下降 （P＜0.01）;G2/M期以及S期細(xì)胞百分率和PI值均明顯增高 （P＜0.01或P＜0.05）;其中，高、低劑量組AI值均低于維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P ＜0.01）。結(jié)果詳見表1。

表1 各組大鼠胃組織細(xì)胞凋亡及不同時期增殖時相比率的結(jié)果比較（±s），n=10

表1 各組大鼠胃組織細(xì)胞凋亡及不同時期增殖時相比率的結(jié)果比較（±s），n=10

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與維酶素組和三九胃泰組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 AI G0/G1（%） G2/M（%） S（%）PI正常組 10.31±1.51＊＊ 75.68±6.24＊＊ 9.51±0.66* 14.42±1.55* 23.96±2.46＊＊模型組 24.46±3.12 80.89±8.85 7.73±0.88 11.28±0.92 18.96±1.83高劑量組 14.55±2.78＊＊△△ 73.21±7.71＊＊ 11.55±1.75＊＊ 15.16±1.16* 26.59±2.37＊＊低 劑 量組 15.84±3.03＊＊△ 74.48±8.92＊＊ 11.41±1.92＊＊ 15.38±0.52＊＊ 26.81±3.02＊＊維霉素組 17.83±2.89＊＊ 75.83±6.84＊＊ 10.82±1.52＊＊ 14.18±1.73* 24.92±2.63＊＊三九胃泰組 17.41±3.88＊＊ 75.49±5.65＊＊ 11.16±1.28＊＊ 13.69±0.88* 24.89±1.13＊＊

3.2 益胃祛瘀消痰方對CAG大鼠胃組織細(xì)胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達(dá)的影響 模型組與正常組比較，大鼠Caspase3和Fas蛋白表達(dá)FI值均升高，而 Bcl－2蛋白表達(dá) FI值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。經(jīng)用藥治療后，各治療組Fas、Caspase3蛋白表達(dá)FI值均低于模型組，Bcl－2蛋白表達(dá)FI值均高于模型組 （P＜0.05或P＜0.01）;其中，高、低劑量組的Caspase3蛋白表達(dá)FI值均低于維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P＜0.05）;高劑量組Fas蛋白表達(dá)FI值低于低劑量組、維霉素組和三九胃泰組 （P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果詳見表2。

表2 各組大鼠胃組織細(xì)胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達(dá)變化（±s），n=10

表2 各組大鼠胃組織細(xì)胞Caspase3、Bcl－2、Fas蛋白表達(dá)變化（±s），n=10

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與維酶素組和三九胃泰組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別Caspase3 FI Fas FI Bcl－2 FI正常組 1.03±0.01＊＊ 0.83±0.13＊＊ 1.00±0.15＊＊模型組 1.32±0.03 1.28±0.21 0.74±0.21高劑量組 1.06±0.02＊＊△ 0.89±0.12＊＊△△ 0.98±0.19＊＊低劑量組 1.07±0.03＊＊△ 1.08±0.23* 0.95±0.11＊＊維霉素組 1.18±0.03＊＊ 1.12±0.21* 0.92±0.08＊＊三九胃泰組 1.16±0.02＊＊ 1.06±0.18* 0.97±0.11＊＊

4 討論

中醫(yī)學(xué)中無CAG的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)的“胃痞”“胃脘痛”“嘈雜”等疾病范疇，其病因多是由于飲食不節(jié)、或情志不遂、或操勞過度，損傷脾胃等，漸致脾胃損傷，氣機(jī)失調(diào)，胃絡(luò)瘀阻，濕阻痰生。氣陰不足，痰瘀互阻為本病的主要病機(jī)，益氣養(yǎng)陰，祛瘀消痰為其有效治療方法。故益胃祛瘀消痰方中選用黃芪、白術(shù)、茯苓益氣健脾，麥冬、炒白芍、炙甘草酸甘化陰，柔肝和胃，丹參、赤芍、莪術(shù)活血祛瘀，清半夏、白芥子燥濕消痰，陳皮、黃連、丁香通降胃氣。諸藥合用，脾氣得補，胃陰得充，氣機(jī)得暢，血脈暢通，濕祛痰生，故治療CAG可獲滿意的療效。

胃組織細(xì)胞的過度凋亡，可嚴(yán)重影響胃的生理功能。Bcl－2與Fas是與細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切的基因，兩者的作用各不相同。Bcl－2基因主要作用是通過抗細(xì)胞凋亡，以延長細(xì)胞壽命，促進(jìn)細(xì)胞生存 。［2］Fas基因為細(xì)胞膜表面受體蛋白，它是與T淋巴細(xì)胞膜上Fas－L結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞“死亡信號”，誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡［3］，Caspase3是Caspase家族成員之一，是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase3介導(dǎo)的凋亡在人體多種類型細(xì)胞中普遍存在著，其降解凋亡標(biāo)志性底物的活性最強(qiáng)。Caspase3可被該家族其它成員如Caspase9和6激活。Bcl－2，Bcl－xL等抗凋亡蛋白可通過與Fas等促凋亡蛋白形成異二聚體阻止線粒體釋放細(xì)胞色素 C（cyt－c），或直接與 a－paf－1、Caspase9結(jié)合成三元復(fù)合物從而阻止Caspase9途徑的激活，Caspase3不能被活化，因而細(xì)胞凋亡受抑制。［4］本項研究結(jié)果表明，模型組大鼠的胃組織中細(xì)胞凋亡率最高，同時 Bcl－2表達(dá)量最低，Caspase3和Fas表達(dá)量最高;說明Caspase3和Fas表達(dá)上調(diào)、Bcl－2表達(dá)下調(diào)，是造成細(xì)胞凋亡增加的原因之一。經(jīng)藥物治療后，與模型組相比，各治療組Bcl－2表達(dá)量明顯增加，Caspase3和Fas表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯下降，說明益胃祛瘀消痰方能夠加速胃組織細(xì)胞的DNA合成及分裂增殖，抑制胃組織細(xì)胞過度凋亡，以保證胃組織細(xì)胞的正常功能，從而達(dá)到抗CAG的作用，此可作為益胃祛瘀消痰方治療CAG的作用機(jī)制之一。

［1］ 李紅平，毛萬姬，鄒學(xué)正.丹白麥門冬湯對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理形態(tài)學(xué)的影響 ［J］.陜西中醫(yī)，2007，28（2）:243－245

［2］ LalierL，Cartron PF，Juin P，et a1.Bax activation and mitochon－ drial insertion during apoptosis ［J］ .Apoptosis，2007，12（5）:887－896

［3］ Lockshin RA.Programmed celldeath:history and future ofa con －cept［J］ .JSoc Biol，2005，199（3）:169 －73

［4］ 于利利，王澤華.Bcl－xL和Caspase3在人卵巢癌細(xì)胞株凋亡過程中的調(diào)節(jié)作用 ［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版），2003，32（2）:205－207

（2014－03－07 收稿）