楊遲　林金杏　胡建華

摘要近年來，隨著現(xiàn)代生命科技的不斷深入研究，斑馬魚因其獨(dú)特的生物學(xué)特性已成為一種重要的脊椎動(dòng)物模式生物，是國際上應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)魚類。但是目前在我國，對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制及監(jiān)督管理制度。闡述了斑馬魚的主要細(xì)菌性疾病及常見病原菌的質(zhì)量控制，以期為實(shí)驗(yàn)用魚的標(biāo)準(zhǔn)化制定及應(yīng)用提供一定的參考。

關(guān)鍵詞斑馬魚；病原菌；質(zhì)量控制；標(biāo)準(zhǔn)化

中圖分類號(hào)S965.819文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）04-01068-03

基金項(xiàng)目國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAK11B02）。

作者簡(jiǎn)介楊遲（1990- ），女，貴州貴陽人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物微生物質(zhì)量控制。*通訊作者，胡建華，研究員，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)控。*通訊作者，林金杏，博士，從事實(shí)驗(yàn)用魚類生理功能及質(zhì)量控制。

斑馬魚作為一種國際上應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)魚類，已成為一種重要的模式生物，被廣泛用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究[1-3]，但我國對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化的研究還相對(duì)落后[4-5]。隨著對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚研究的不斷深入，對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化的研究制定也顯得越來越重要，而微生物的質(zhì)量控制則是該標(biāo)準(zhǔn)體系不可或缺的重要一環(huán)。筆者分析并整理了由常見病原菌感染引起的斑馬魚疾病及其相關(guān)研究等數(shù)據(jù)資料，對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的微生物質(zhì)量控制進(jìn)行了闡述，旨在為今后實(shí)驗(yàn)用魚的標(biāo)準(zhǔn)化制定及應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)用斑馬魚

1.1斑馬魚的生物學(xué)特性斑馬魚（Danio rerio，Zebrafish）又名藍(lán)條魚、花條魚等，隸屬脊椎動(dòng)物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、短擔(dān)尼魚屬，原產(chǎn)于南亞，是一種常見的熱帶觀賞魚。斑馬魚整體上呈紡錘型，身體細(xì)長(zhǎng)，一般成魚體長(zhǎng)3～5 cm，約3～4月齡即可達(dá)到性成熟，每隔1周可進(jìn)行1次交配，產(chǎn)卵數(shù)量在幾百粒左右[6-8]。雌雄鑒別比較容易，雄魚為深藍(lán)間檸檬色條紋，且魚體修長(zhǎng)，鰭大；雌魚為藍(lán)色間銀灰色條紋，魚體比較肥大，體色偏淡，各鰭均比雄魚短小，懷卵期魚腹膨大明顯[9]。

1.2斑馬魚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指經(jīng)人工飼養(yǎng)對(duì)其攜帶的微生物實(shí)行控制，遺傳背景明確且來源清楚，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物[10-11]。近年來，斑馬魚作為一種新型的模式生物，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域的研究，其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的基礎(chǔ)與其自身所具備的幾種生物學(xué)優(yōu)勢(shì)密切相關(guān)：①斑馬魚卵子體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育同步且胚體透明，易于活體觀察；②生長(zhǎng)發(fā)育快，繁殖能力強(qiáng)，受精后24 h主要器官原基基本形成，便于組織器官的發(fā)育及功能研究；③個(gè)體小，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)成本低，能大規(guī)模繁育[12-13]。此外，隨著其基因組測(cè)序工程的完成，斑馬魚的基因與人類的基因保守度達(dá)到85%，另外具有許多獨(dú)特、易于鑒別的由基因調(diào)控的表型（如體色、魚鰭等），可形成不同品系，而且細(xì)胞標(biāo)記、組織移植等技術(shù)已經(jīng)成熟，以上均為其成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的典型提供了強(qiáng)有力的支撐[14]。

2斑馬魚的主要細(xì)菌性疾病

實(shí)現(xiàn)斑馬魚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化，其核心技術(shù)在于對(duì)斑馬魚的疾病控制及其健康狀態(tài)的維持。斑馬魚的疾病發(fā)生主要與以下因素有關(guān)：斑馬魚的來源及是否與感染魚群有過接觸；飼養(yǎng)的水環(huán)境（如水體硬度、溫度、溶氧量、致病性微生物污染情況等）飼料的性狀及營養(yǎng)；飼養(yǎng)管理的規(guī)范化水平等[15-16]。在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件下，以細(xì)菌為代表的病原微生物則是干擾斑馬魚健康的主要原因[17]。

2.1細(xì)菌性敗血病細(xì)菌性敗血病又稱為爆發(fā)性流行病、出血性腹水病等，具有發(fā)病急、流行廣、死亡率高等特點(diǎn)，是目前危害斑馬魚健康的最為嚴(yán)重的疾病之一[18]。該病可由嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌等多種病原菌引起，患病魚的主要癥狀表現(xiàn)為魚體各組織器官出現(xiàn)不同程度的出血現(xiàn)象。在發(fā)病早期，通過外表觀察發(fā)現(xiàn)病魚上下頜、口腔、鰓蓋、眼眶、鰭及魚體兩側(cè)輕度充血，剖開腹腔在腸道內(nèi)仍可見少量食物。隨著病情的發(fā)展，體表充血現(xiàn)象加劇，肌肉充血，眼球突出，鰓絲末端腐爛，肛門紅腫，腹部膨大，此時(shí)解剖可見由于內(nèi)臟器官受損導(dǎo)致腹腔內(nèi)積有黃色或紅色腹水，鰓、肝、腎的顏色較淡，呈花斑狀，腸壁充血且無食物[19]。

2.2細(xì)菌性爛鰓病細(xì)菌性爛鰓病通常是由柱狀嗜纖維菌或柱狀屈撓桿菌感染所致，該病流行的最適水溫為28～35 ℃，主要感染部位為斑馬魚的鰓部[20]。病魚常伴有離群獨(dú)游、行動(dòng)遲緩、體色發(fā)黑、呼吸困難、食欲減退以及對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等癥狀。肉眼觀察可見爛鰓病魚的鰓瓣呈泥灰色，鰓絲末端尤為嚴(yán)重，黏液增多，鰓蓋內(nèi)表面充血發(fā)炎，中間部位常糜爛成1個(gè)圓形或不規(guī)則的透明小窗，俗稱“開天窗”。嚴(yán)重時(shí)，鰓小片壞死脫落，鰓絲末端缺損，鰓絲軟骨外露；在病變鰓絲的周圍常有附著物粘附[21]。

2.3分支桿菌病分枝桿菌病是斑馬魚一種常見的細(xì)菌性疾病，又稱為結(jié)核病，由于斑馬魚對(duì)分枝桿菌具有天然的敏感性，因此該細(xì)菌對(duì)實(shí)驗(yàn)斑馬魚構(gòu)成了巨大的威脅，影響了許多重要的科學(xué)實(shí)驗(yàn)[22]。國際斑馬魚資源中心（ZIRC）的調(diào)查診斷也表明，從1999年9月至2003年6月，分支桿菌占所有感染性的18%[15]，是斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化首先要凈化的疫病病原之一。該菌屬于Actinomycetales綱Mycobacteriaceae科，為抗酸好氧非運(yùn)動(dòng)型桿菌。分枝桿菌病屬于一種慢性的全身性感染疾病，感染病魚的主要臨床癥狀表現(xiàn)有為：游動(dòng)緩慢，無食欲和消瘦，萎靡不振，呼吸急促，眼睛上有霧狀物或者眼球突出。頭部及體表?？梢姷匠溲斑吘壡逦臐兊阮愃茢⊙Y的癥狀，最典型的特征是在不同的內(nèi)部器官上都可以見到多個(gè)白色結(jié)節(jié)（肉芽腫），且結(jié)節(jié)中心可能伴有壞死現(xiàn)象[23]。

2.4愛德華氏菌病愛德華氏菌病又稱為腹水病，發(fā)病原因通常是由于遲緩愛德華氏菌感染所致。該細(xì)菌為短桿菌，無莢膜，具有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏陰性，是一種重要的條件致病性人畜共患病原菌[24]。感染病魚的主要癥狀表現(xiàn)為腹部腫大，肛門擴(kuò)張發(fā)紅，眼球突出且呈白濁化，食欲減退，游動(dòng)緩慢，部分失去平衡，有時(shí)可見鰓或沿脊柱大血管至鰭條有充血現(xiàn)象[25]。

3實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的細(xì)菌質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被國際學(xué)界公認(rèn)為“活的精密儀器”，其區(qū)別于其他動(dòng)物的最顯著特征是其需要實(shí)施嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制[26]。斑馬魚作為魚類模型動(dòng)物應(yīng)用最為廣泛的代表，雖已通過純化培育等方式獲得了較高的遺傳均一性，但在細(xì)菌質(zhì)量控制及特定病原凈化方面與小鼠等法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仍存在較大差距，需進(jìn)一步建立完善無疾病的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)斑馬魚群[16]。

由于水生動(dòng)物的生物凈化相較于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在較多的技術(shù)難題，特別是其生活的水環(huán)境是各類水生微生物生存繁殖的最佳環(huán)境，造成凈化工作較難開展及凈化后的環(huán)境維持困難[27]。為了針對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚在實(shí)驗(yàn)室集約化人工養(yǎng)殖過程中環(huán)境的改變及污染可能對(duì)斑馬魚健康所造成的威脅實(shí)施控制，定期對(duì)斑馬魚及其水環(huán)境進(jìn)行細(xì)菌學(xué)的質(zhì)量監(jiān)測(cè)則顯得尤為重要。

3.1實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)是微生物學(xué)監(jiān)測(cè)的重要組成部分之一，定期對(duì)斑馬魚進(jìn)行細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)是為了了解和控制細(xì)菌性疾病在實(shí)驗(yàn)斑馬魚中的發(fā)生和流行，從而進(jìn)一步對(duì)其微生物質(zhì)量實(shí)施有效控制[28]。針對(duì)斑馬魚細(xì)菌學(xué)質(zhì)量監(jiān)測(cè)的對(duì)象選擇問題，需遵循幾條原則，具體見表1[29]。

3.2實(shí)驗(yàn)用斑馬魚常見病原菌的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件下，病原菌是干擾斑馬魚健康狀態(tài)的重要病原，需定期對(duì)實(shí)驗(yàn)斑馬魚進(jìn)行細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)，以確保其用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量[15，30]。

目前，我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的主要內(nèi)容包括標(biāo)本的采集、細(xì)菌的培養(yǎng)及細(xì)菌的鑒定分類。參考我國對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物控制分類[31]，建議將實(shí)驗(yàn)用斑馬魚分為普通級(jí)和無特定病原體級(jí)，其常見的病原菌監(jiān)測(cè)指標(biāo)主要包括分支桿菌、遲緩愛德華氏菌、氣單胞菌、假單胞菌和鏈球菌等[13，15]。

3.3實(shí)驗(yàn)用斑馬魚的細(xì)菌檢測(cè)流程首先，從外觀指標(biāo)上，合格的實(shí)驗(yàn)用斑馬魚應(yīng)外觀健康，無異常；其次，需要進(jìn)一步進(jìn)行病原微生物指標(biāo)的檢測(cè)，不同等級(jí)的斑馬魚對(duì)病原微生物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異。針對(duì)斑馬魚易感的病原微生物檢測(cè)，主要包括病原微生物的分離和鑒定等內(nèi)容[5，32]。實(shí)驗(yàn)用斑馬魚病原菌的常見檢測(cè)程序如圖1所示。

圖1實(shí)驗(yàn)用斑馬魚病原菌的檢測(cè)程序3.4實(shí)驗(yàn)用斑馬魚細(xì)菌檢測(cè)中的生物安全控制與預(yù)防實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測(cè)中的生物安全涉及到以下內(nèi)容：病原菌的危害與鑒定以及所用到的有害化學(xué)藥品試劑等。在對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚細(xì)菌檢測(cè)的實(shí)際操作過程中，生物安全水平控制與預(yù)防主要取決于以下因素：病原菌的毒力、生物穩(wěn)定性、致病性、傳播途徑、傳染性及實(shí)驗(yàn)室的性能與功能、檢測(cè)操作技術(shù)與方法等，熟悉并掌握其危害根源并做好周全的防范措施是確保生物安全的前提和保障，也是做好實(shí)驗(yàn)斑馬魚細(xì)菌質(zhì)量控制的有力后盾[32-33]。

4展望

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要指標(biāo)，對(duì)保證實(shí)驗(yàn)研究的順利進(jìn)行和工作人員的身體健康以及確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性等都具有重要意義。細(xì)菌檢測(cè)作為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚微生物質(zhì)量不可或缺的重要一環(huán)，引起了各國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究機(jī)構(gòu)及科研人員的廣泛關(guān)注，并已針對(duì)某些病原菌的質(zhì)量控制及檢測(cè)方法展開了一系列研究。

筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚這種新型的模式動(dòng)物進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。斑馬魚本身具有許多形態(tài)學(xué)和生物學(xué)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其在近年來被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等各領(lǐng)域的研究，然而其目前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化方面還存在欠缺，特別是以斑馬魚的疾病控制與健康狀態(tài)維持密切相關(guān)的病原微生物質(zhì)量控制問題應(yīng)引起足夠的重視。

參考文獻(xiàn)

[1] FETCHO J R，HIGASHIJIMA S，MCLEAN D L.Zebrafish and motor control over the last decade[J].Brain Res Rev，2008，57：86-93.

[2] TAVARES B，SANTOS LOPES S.The importance of zebrafish in biomedical research[J].Acta Med Port，2013，26（5）：583-592.

[3] 劉昌盛，穆宇，杜久林.斑馬魚在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2007，19（4）：382-384.

[4] WATRAL V，KENT L M.Pathogenesis of Mycobacterium spp.in zebrafish （Danio rerio） from research facilities [J].Comp Biochem Physiol C，2007，145：55-60.

[5] CRIM M J，RILEY L K.Viral diseases in zebrafish：what is known and unknown[J].ILAR J，2012，53（2）：135-143.

[6] BERRY J P，GANTAR M，GIBBS P D L，et al.The zebrafish （Danio rerio） embryo as a model system for identification and characterization of developmental toxins from marine and freshwater microalgae[J].Comp Biochem Physiol C，2007，145（1）：61-72.

[7] 董武.斑馬魚及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國海洋大學(xué)出版社，2006：1-2.

[8] 邵潘柱，林金杏，胡建華.斑馬魚實(shí)驗(yàn)室繁育方法研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（14）：6282-6284.

[9] 耿波，曹頂臣，孫效文，等.斑馬魚——新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2006，19（2）：106-108.