王建軍 姚永良 陳偲 吳建紅 趙淑玲 湯立軍

摘要：利用佛波酯體外分化人急性單核白血病細胞形成巨噬細胞，并用低溫超速離心法從巨噬細胞培養(yǎng)上清收集Exosomes，并分析其生物學(xué)特征。Exosomes經(jīng)透射電顯微鏡分析形態(tài)，并用Western blot方法分析Exosomes膜上特異性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70的表達對其生物學(xué)特征進行鑒定。研究結(jié)果表明佛波酯成功誘導(dǎo)人急性單核白血病細胞分化成人巨噬細胞。獲得的巨噬細胞分泌微小囊泡經(jīng)透射電鏡分析后，微小囊泡的直徑在30～100nm，并且其含有Exosomes的特征性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70等蛋白，表明其為Exosomes，使用低溫超速離心法成功收集到Exosomes，為后續(xù)開展Exosomes的成份及功能分析提供了保障。

關(guān)鍵詞：巨噬細胞：Exosomes；透射電鏡；超速離心

中圖分類號：Q28

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）04-0283-03

Johnstone等研究網(wǎng)織紅細胞發(fā)育時，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織紅細胞成熟過程中會分泌出一種囊泡狀物質(zhì)，于是分離純化了該物質(zhì)并命名為Exosomes。目前研究認(rèn)為Exosomes由細胞內(nèi)多泡體（muiti-vesicular body， MVB）與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的一種直徑約30～100nm的膜性囊泡，這些小囊泡具有呈遞生物相關(guān)抗原與免疫治療作用的特性。

巨噬細胞是目前功能最強的抗原呈遞細胞，能刺激初始型T細胞增殖，激發(fā)機體免疫應(yīng)答。巨噬細胞分泌的Exosomes主要表達MHC分子、共刺激分子及特異性抗原肽，并能將抗原刺激信號運送到抗原遞呈細胞（antigen-presenting cells，APC）或T淋巴細胞從而誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。近些年來Exosomes在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤治療、疫苗開發(fā)等方面的作用已經(jīng)引起科研人員的極大關(guān)注并已經(jīng)展開了許多基礎(chǔ)與臨床研究。

但由于Exosomes直徑一般在30～100nm內(nèi)，很難從細胞上清中分離及獲得純度較高的Exo-somes。本文主要利用低溫超速離心方法收集巨噬細胞分泌的Exosomes，并對其形態(tài)學(xué)與生物學(xué)特性進行初步的分析鑒定，為后續(xù)實驗研究奠定了實驗技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

人單核白血病細胞系THP-1來自武漢大學(xué)保藏中心。

1.2試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hy-clone公司，CD80、ICAM-3、HSP-70抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司、佛波酯（12-鄰-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，PMA）購自德國默克公司，Cocktail蛋白酶抑制劑購自長沙海揚生物技術(shù)公司、蔗糖、磷鎢酸均購白南京金斯瑞生物技術(shù)公司。

美國Beckman超速離心機；日本日立透射電子顯微鏡；美國Forma Scientific CO2細胞培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡（Olympas）；中國六一垂直電泳儀。

1.3 細胞培養(yǎng)

THP—l細胞于含10%胎牛血清的RPMl-1640培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)48h后，0.1mmol/L PMA誘導(dǎo)THP-1細胞24h，使其分化形成巨噬細胞。

1.4Exosomes收集

收集巨噬細胞上清液，4℃，4000r/min，離心20min，保留上清；4℃，10000r/min，離心45min，保留上清；4℃，32000r/min，離心60min，保留沉淀，9%蔗糖溶液200μL、lOOx蛋白酶抑制劑2μL溶解沉淀；4℃，40000r/min，離心45min保留沉淀，9%蔗糖溶液50μL、lOOx蛋白酶抑制劑lμL溶解沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Exosome透射電鏡鑒定

取10μL新鮮Exosomes溶液，3%磷鎢酸染色5min，將Exosomes滴于銅網(wǎng)膜，65℃烤干，透射電鏡下觀察其形態(tài)大小并拍照保存分析Exo-somes提純質(zhì)量。

1.6Western blot

Bradford方法測定Exosomes蛋白濃度；配制10%SDS-PAGE電泳凝膠，將變性后的蛋白質(zhì)按50μg的蛋白質(zhì)總量上樣電泳，然后通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以免抗人CD80、I—CAM-3、HSP-70抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進行免疫反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

2結(jié)果

2.1佛波酯（PMA）誘導(dǎo)THP-1分化成巨噬細胞

THP-1細胞培養(yǎng)48h后細胞密集度達80%后的生長情況，THP-1細胞經(jīng)0.1mmol/LPMA誘導(dǎo)24h后，分化形成梭形巨噬細胞（圖1），分化形成的類巨噬細胞具很強的吞噬功能。

2.2透射電鏡鑒定Exosomes

10μL新鮮Exosomes溶液，與3%磷鎢酸2μl染色5min后，Exosomes溶液輕輕滴于銅網(wǎng)膜，65℃烤干，透射電鏡下觀察Exosomes形態(tài)學(xué)特征（圖2A），并利用NanoSight統(tǒng)計系統(tǒng)分析Exosomes溶液中囊泡直徑大小，并繪制曲線（圖2B）。

2.3Exosomes膜蛋白表達

CD80、ICAM-3和HSP-70 3種蛋白質(zhì)在不同細胞來源的Exosomes上均有表達，目前認(rèn)為這3種蛋白質(zhì)可以作為Exosomes的特征蛋白質(zhì)。Western blot研究分析巨噬細胞分泌的Exosomes膜上CD80、ICAM-3、HSP-70的表達（圖3）。

3討論

近年來，越來越多的實驗結(jié)果證明：樹突狀細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生的Exosomes具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，可轉(zhuǎn)運腫瘤抗原至抗原提呈細胞，誘導(dǎo)細胞毒性T-淋巴細胞反應(yīng)，產(chǎn)生和增強抗原特異性免疫應(yīng)答；Exosomes的非細胞性及其不易被體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)喪失活性、無繁殖能力、穩(wěn)定性高、體積小易清除、儲藏時間長等優(yōu)點，使Exosomes有可能成為一種很有潛力的新型無細胞治療性腫瘤疫苗。目前法國科學(xué)家研究的樹突狀來源的Exosomes腫瘤疫苗已經(jīng)進入臨床I期，并且尚未發(fā)現(xiàn)任何副作用。Bard等研究報道，腫瘤來源的Exosomes亦可誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答，如惡性滲出物（胸水、腹水）中的Exosomes同樣含有腫瘤抗原和抗原提呈分子，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤一細胞反應(yīng)。

本研究通過佛波酯PMA在體外誘導(dǎo)人單核白血病細胞分化形成巨噬細胞，并通過超速離心法收集巨噬細胞培養(yǎng)上清中微小囊泡。經(jīng)透射電鏡分析表明收集到的95%的微小囊泡物質(zhì)的直徑在30～100nm范圍內(nèi)，從而證明低溫超速多步離心法成功收集獲得巨噬細胞分泌的Exosomes，該方法可以應(yīng)用于大批量Exosomes的收集以滿足后續(xù)實驗Exosomes的需求。

根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究分析，Exosomes蛋白成分可以分為3類：提呈相關(guān)蛋白質(zhì)如熱休克蛋白、MHC類分子；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)如整合素、膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族；細胞骨架蛋門如肌動蛋白、微管蛋白，不同細胞來源的Exosomes的蛋白質(zhì)有一定差別，而脂質(zhì)成分與質(zhì)膜的成分相似。Exosomes介導(dǎo)細胞間信息傳遞主要通過Exosomes表面蛋白復(fù)合體與不同細胞表面受體配對，在細胞之間沒有直接接觸的情況下進行細胞之間的信號傳導(dǎo)。本實驗采用Western blot方法分析了巨噬細胞來源Exosomes表面的3種特征性蛋白CD80、ICAM-3、HSP-70的表達，實驗再次表明Exosomes的蛋白種類豐富，且不同來源Exosomes的蛋白有一定的共同性。本實驗的初步研究為后續(xù)大規(guī)模收集Exosomes及后續(xù)免疫動物實驗打下了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。