李菲 劉雨芳 孫遠(yuǎn)東 譚樹(shù)華 肖璐 劉文海 莫書銀 桂芳艷

摘 要：為探索轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻對(duì)泥鰍的毒性作用，采用水體中添加不同濃度（10.50、100、200mg/L）的轉(zhuǎn)融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號(hào)（HHl）稻桿粉飼養(yǎng)泥鰍，非轉(zhuǎn)基因親本明恢63（MH63）作對(duì)照，不加稻桿粉為空白對(duì)照，分析了對(duì)泥鰍蛋白水解酶、乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)4個(gè)濃度處理后，泥鰍的胃蛋白水解酶、腸蛋白水解酶和腦AChE、肝臟AChE、肌肉AChE與對(duì)照組泥鰍相比均無(wú)顯著差異（n=3，P>0.05）。高濃度（200mg/L） HH1、MH63組泥鰍胃蛋白水解酶與空白對(duì)照相比均顯著降低（n=3，P<0.05）；低濃度（1Omg/L）HH1組泥鰍肝臟AChE與空白對(duì)照差異顯著（n=3，P<0.05）；不同濃度HH1、MH63稻桿粉對(duì)泥鰍的腸蛋白水解酶、腦AChE和肌肉AChE均無(wú)顯著影響（n=3，P>0.05）。結(jié)果表明：HH1水稻稻桿粉對(duì)泥鰍的消化道蛋白酶和乙酰膽堿酯酶沒(méi)有影響，而水體中高劑量的HH1或MH63稻桿粉均會(huì)降低泥鰍胃的消化能力。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)融合基因CrylAb/Ac水稻；泥鰍；蛋白水解酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號(hào)：Q142.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0189-06

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻通過(guò)靶標(biāo)害蟲(chóng)取食殺蟲(chóng)晶體蛋白，在昆蟲(chóng)堿性腸道內(nèi)溶解，與中腸膜受體結(jié)合，引起細(xì)胞溶解，導(dǎo)致昆蟲(chóng)停止進(jìn)食而致死的方式[1]，對(duì)二化螟（Chilo suppressalis）、三化螟（Try-Poryza，incerlulas）和稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocismedinalis）等鱗翅目害蟲(chóng)具有高度特異抗性，其應(yīng)用能有效降低水稻受蟲(chóng)害侵襲造成的損失，減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題[2-4]。我國(guó)相繼成功培育“克螟稻”和“華恢l號(hào)”等轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻，“華恢1號(hào)”于2009年獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)安全證書（農(nóng)基安證字（2009）第072號(hào)），極有可能有力推動(dòng)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻商業(yè)化種植，與此同時(shí)，由此可臺(tái)能引發(fā)的生態(tài)安全問(wèn)題也再次成為公眾關(guān)注的熱點(diǎn)。

大量的田間調(diào)查顯示，轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻對(duì)非靶標(biāo)害蟲(chóng)白背飛虱（Sogatella furcifera）、黑尾葉蟬（Nephotettix cincticeps）的種群發(fā)生動(dòng)態(tài)沒(méi)有明顯影響[5，6]；對(duì)食蟲(chóng)溝瘤蛛（Ummeliata insecticeps）、黑肩綠盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）等捕食性天敵的物種豐富度和多樣性[7，8]、稻田節(jié)肢動(dòng)物群落的物種組成及豐富度、多樣性[9，10]沒(méi)有顯著影響，但寄生蜂等天敵的數(shù)量明顯降低[11，12]。轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻對(duì)土壤動(dòng)物的安全性評(píng)價(jià)也有大量報(bào)道，如轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻種植后彈尾蟲(chóng)的種類與豐富度沒(méi)有受到明顯影響[13]；而田間土壤跳蟲(chóng)總量受到一定程度的影響，但對(duì)其群落多樣性、均勻度和物種豐富度影響不顯著[14]，土壤線蟲(chóng)數(shù)量及植物寄生線蟲(chóng)成熟度在轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻短期種植下沒(méi)有顯著影響[15]。已有文獻(xiàn)表明轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻的安全性評(píng)價(jià)多偏向于對(duì)地上或土壤生物的研究，缺乏對(duì)稻田水生生物與水體生態(tài)環(huán)境的毒性作用的評(píng)價(jià)研究，不能全面反映轉(zhuǎn)基因水稻的生態(tài)安全性。

在我國(guó)南方“稻一魚(yú)”互作的生態(tài)農(nóng)業(yè)模式中，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），作為水稻田中主要的淡水魚(yú)，通過(guò)覓食、潛穴等游動(dòng)行為對(duì)稻田水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能起到良好的改善作用[16]：同時(shí)，泥鰍對(duì)水體不良脅迫反應(yīng)靈敏，如吳若菁等研究了SO2衍生物、殺蟲(chóng)劑、蘇丹紅Ⅲ等對(duì)泥鰍的急性毒性、遺傳損傷和生理酶活性的影響[17～19]，均顯示泥鰍在評(píng)價(jià)水體污染物對(duì)水生生物的毒理效應(yīng)中可作為良好的指示生物。因此，本研究以泥鰍為指示生物，以轉(zhuǎn)融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號(hào)及其對(duì)應(yīng)親本為實(shí)驗(yàn)材料，基于室內(nèi)調(diào)控試驗(yàn)，開(kāi)展轉(zhuǎn)基因水稻稻桿粉對(duì)泥鰍的消化能力、神經(jīng)傳遞的致害性比較研究，以期評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻秸稈物對(duì)泥鰍生理生化功能的影響，為進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻對(duì)魚(yú)類的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試水稻與稻桿取樣

試驗(yàn)水稻種為轉(zhuǎn)融合基因CrylAb/Ac水稻華恢1號(hào)（簡(jiǎn)稱HH1），及其親本對(duì)照明恢63（簡(jiǎn)稱MH63）。

2012年6月，在湖南省湘潭市湖南科技大學(xué)國(guó)家農(nóng)業(yè)部重大專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)，將試驗(yàn)田分成6塊等面積小區(qū)，轉(zhuǎn)Bt水稻HH1及其親本MH63交替種植，各設(shè)3個(gè)重復(fù)。種植期間不施用化學(xué)殺蟲(chóng)劑與除草劑，其余水肥按常規(guī)農(nóng)事操作與管理。于水稻成熟期（10月），隨機(jī)選取不同品種稻株，去除稻穗，留下水稻植株遠(yuǎn)根處10cm莖干，保鮮袋分裝，帶回實(shí)驗(yàn)室，晾干粉碎，制成稻桿粉，-20℃冷藏備用。

1.2供試泥鰍

泥鰍購(gòu)自湖南省湘潭市潤(rùn)田水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，殺菌消毒后，于水族箱（70cmx65cmx50cm）內(nèi)馴養(yǎng)，用水為充分曝氣除氯（1d）的自來(lái)水，投喂飼料購(gòu)自湖南省湘潭市潤(rùn)田水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，飼料主要成分為粗蛋白（340/0）、粗纖維（17%）、灰分（17%）、食鹽（4%）、總磷（2.2%）、鈣（4%）、賴氨酸（1.5%）、蛋氨酸（0.2%）、水分（lO%）等。

1.3泥鰍飼喂設(shè)計(jì)

挑選健康活躍、體表無(wú)損傷的規(guī)格泥鰍45尾，測(cè)得初始平均體長(zhǎng)為（7.69±0.08）cm，平均體重為（1.70±0.07）g，隨機(jī)分成9組，每組5個(gè)重復(fù)，于容積1L的燒杯中單尾飼養(yǎng)（盛充氣24h自來(lái)水800mL），加HH1稻稈粉為試驗(yàn)組（4組），加MH63稻稈粉為對(duì)照組（4組），1組不添加任何稻桿粉為空門對(duì)照。

泥鰍飼養(yǎng)于人工氣候室內(nèi)（100d），溫度（23±1）℃，光周期（10L：14D）。期間每天定時(shí)換水，添加稻桿粉并喂食，投餌量為泥鰍初始體重的4%.根據(jù)國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB11607-89，漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)懸浮物質(zhì)<10mg/L，稻桿粉設(shè)4個(gè)濃度，分別為10、50、100、200mg/L。

以水體pH和溶氧量（DO）為指標(biāo)，測(cè)定了試驗(yàn)用水在投放稻桿粉飼養(yǎng)泥鰍24h始末的理化性質(zhì).酸堿度測(cè)定采用PH-033 waterproof Pen-type pH Meter，溶解氧含量測(cè)定采用碘量法（表1）。

1.4酶液制備與酶活性測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，活體解剖泥鰍，取其腦、肝臟、肌肉、胃和腸組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干、稱重，進(jìn)行粗酶液制備。胃和腸組織按照質(zhì)量體積比1：8加人生理鹽水（4℃），冰浴勻漿，勻漿液靜置1h后（4℃），以7000r/min在4℃下離心20min，取上清液作為蛋白水解酶待測(cè)液。腦、肝臟和肌肉按照質(zhì)量體積比1：10加入pH8.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，冰浴勻漿，勻漿液于高速冷凍離心機(jī)上以10000r/min離心30 min（4℃），取上清液作為乙酰膽堿酯酶待測(cè)液。

蛋白水解酶活性f201測(cè)定采用福林一酚試劑法，酶活性定義為每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個(gè)蛋白酶活力單位。乙酰膽堿酯酶活性[21]測(cè)定采用Ellman法，酶活力定義為每毫克腦（肝臟、肌肉）組織每分鐘水解底物的摩爾數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)Shapiro-Wilk和Levene對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較平行組間轉(zhuǎn)基因水稻品種和親本對(duì)照泥鰍酶活性的差異。運(yùn)用Duncan's多重檢驗(yàn)法分析每一品種水稻不同稻桿粉濃度處理組與空白對(duì)照之間的差異顯著性。

2結(jié)果

2.1胃蛋白水解酶

經(jīng)兩個(gè)品種不同濃度的稻桿粉喂養(yǎng)后，泥鰍的胃蛋白水解酶均隨稻桿粉濃度增加明顯降低，但HH1與MH63平行組間沒(méi)有顯著差異（表2）。10mg/L與200mg/L稻桿粉處理后，HH1組泥鰍胃蛋白水解酶略高于MH63（n=3，P>0.05）；50mg/L、100mg/L稻桿粉處理后泥鰍胃蛋白水解酶均略低于對(duì)照MH63 （n=3，P>0.05）。而添加HH1、MH63稻桿粉后，泥鰍的胃蛋門水解酶均不同程度地低于空白對(duì)照，其中，高濃度（200mg/L）HHl與MH63組泥鰍均顯著低于空白對(duì)照（n=3，P<0.05）（圖1）。

圖1 HH1稻桿粉對(duì)泥鰍胃蛋白水解酶的影響

圖中數(shù)據(jù)標(biāo)注為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）；不同小寫字母表示同一品種稻桿粉的不同濃度處理之間的差異顯著（P<0.05）。圖2—5同。

Fig.l Effects of HHl straw powder on activity of pro-teolytic enzyme in stomach of M.anguillicaudatus

Bar charts （x±Sx） with different lowercase letters mean thesignificant difference in vanous concentration of the samerice straw powder（P<0.05）. Same with Fig.2～5。

2.2腸蛋白水解酶

與對(duì)照MH63相比，不同濃度的HH1稻桿粉處理后，泥鰍的腸蛋白水解酶沒(méi)有顯著變化（表2）。其中，10mg/L、50mg/L HH1組略低于MH63（n=3，P>0.05）；100mg/L、200mg/L HH1組略高于MH63（n=3，P>0.05）。與空白對(duì)照相比，HH1組與MH63組泥鰍的腸蛋白水解酶均隨稻桿粉濃度增加而逐漸降低，但差異不顯著（n=3，P>0.05）（圖2）。

圖2HH1稻桿粉對(duì)泥鰍腸蛋白水解酶的影響

Fig.2

Effects of HHl straw powder on activity of prote-olytic enzyme in intestine of M. anguillicaudatus

2.3腦部乙酰膽堿酯酶

10mg/L HH1組泥鰍腦部的AChE活性略低于對(duì)照MH63，但無(wú)顯著差異（n=3，P>0.05）；中高濃度（50、100、200mg/L）HHl組泥鰍腦部AChE活性均略高于MH63，無(wú)顯著差異（n=3，P>0.05）（表2）。而經(jīng)不同濃度HH1、MH63稻桿粉處理后，泥鰍腦部的AChE活性均略高于空白組，但沒(méi)達(dá)到顯著差異（n=3，P>0.05）（圖3）。

圖3 HH1稻桿粉對(duì)泥鰍腦部乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.3 Effects of HHl straw powder on activity of AChEin brain of M.anguillicaudatus

2.4肝臟乙酰膽堿酯酶

從圖4可以看出，不同濃度的HH1稻桿粉對(duì)泥鰍肝臟的AChE活性與MH63相比沒(méi)有顯著影響（表2），且HH1組與MH63組泥鰍肝臟AChE活性變化趨勢(shì)相似，均隨稻桿粉濃度增加而逐漸降低且始終高于空白對(duì)照，其中，10 mg/L HH1組顯著高于空白組（n=3，P<0.05）。

圖4 HH1稻桿粉對(duì)泥鰍肝臟乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.4

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin liver of M.anguillicaudatus

2.5肌肉乙酰膽堿酯酶

與MH63組相比，4個(gè)濃度水平的HH1稻桿粉處理對(duì)泥鰍肌肉AChE活性沒(méi)有顯著影響（表2）。經(jīng)10、50mg/L稻桿粉處理后，HH1組泥鰍肌肉AChE活性不同程度地高于對(duì)照MH63 （n=3，P>0.05）；而100、200mg/L HH1組略低于MH63組（n=3，P>0.05）。HH1組、MH63組與空白對(duì)照均無(wú)顯著差異性（n=3，P>0.05）（圖5）。

圖5 HH1稻桿粉對(duì)泥鰍肌肉乙酰膽堿酯酶的影響

Fig.5

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin muscle of M.anguillicaudatus

3討論

3.1轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)泥鰍蛋白水解酶的影響

泥鰍屬雜食性魚(yú)類，水體中適度的稻桿粉可增加泥鰍食源的豐富度促進(jìn)取食，蛋白水解酶的主要功能是將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段，其活性高低可直接影響動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稻桿粉濃度相同時(shí)，HH1水稻對(duì)泥鰍的胃、腸蛋白水解酶與MH63相比沒(méi)有顯著影響，但均隨稻桿粉濃度的增加呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明泥鰍的消化道蛋白酶活性與稻桿粉品種沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)，而受濃度的影響。

注：表中F值為組間均方與組內(nèi)均方之比，表示F檢驗(yàn)水平。P值代表顯著性差異水平，P>0.05時(shí)，表示HH1組均數(shù)與MH63組均數(shù)之間無(wú)顯著性差異。

Notes：Values of F in the table shows the analysis of variance level， for the ratio of the groups mean squareand within group.Values of P represents the level of significant difference， P>0.05 means no significant dif-ference belween the HHl group and MH63 group。

有胃魚(yú)中胃是主要的消化器官，本實(shí)驗(yàn)中泥鰍的胃蛋白水解酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腸蛋白水解酶，這與Ana等對(duì)魚(yú)類蛋白酶活性的研究結(jié)果一致[23～25]。少量的稻桿粉進(jìn)入泥鰍胃部，胃腺分泌蛋白水解酶、纖維素酶、淀粉酶等消化酶促進(jìn)食物的分解，當(dāng)雜食性魚(yú)類取食植物性食物時(shí)淀粉酶分泌較多，因此試驗(yàn)中低濃度處的胃蛋白水解酶活性均略低于空白對(duì)照。但大量的稻桿粉會(huì)使水體pH和溶解氧等環(huán)境惡化，且較多的懸浮物會(huì)阻礙泥鰍的呼吸與濾食，直接影響泥鰍的正常取食與蛋白酶活性，使得高濃度組泥鰍胃蛋白水解酶活性顯著降低。由于稻桿粉經(jīng)胃部分解后進(jìn)入腸道的含量較少，因此HH1或MH63組泥鰍腸蛋白水解酶均受影響程度較弱。總之，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的稻桿粉濃度水平內(nèi)，相同濃度的HH1與MH63組間泥鰍胃蛋白水解酶、腸蛋白水解酶沒(méi)有顯著差異。

3.2轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)泥鰍乙酰膽堿酯酶的影響

郭文娟用轉(zhuǎn)CrylAb/Ac基因水稻莖干飼喂靶標(biāo)害蟲(chóng)大螟后其體內(nèi)AChE活性顯著降低[26]，周穎研究表明轉(zhuǎn)CrylAb基因水稻對(duì)蜘蛛體內(nèi)AChE活性沒(méi)有影響[27]，肖能文用CrylAc蛋白人造土壤處理赤子愛(ài)勝蚓也表明對(duì)其AChE活性沒(méi)有影響[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水體添加10～200mg/L稻桿粉后泥鰍腦、肝臟和肌肉的AChE酶活性與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢o(wú)顯著差異。

乙酰膽堿是促進(jìn)突觸傳導(dǎo)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，由軸突末梢釋放后穿過(guò)突觸間隙引起受體產(chǎn)生動(dòng)作電位，AChE可將其水解為膽堿和乙酸，終止突觸傳遞，保證生物體神經(jīng)信號(hào)的正常傳導(dǎo)[29]。AChE易受不良環(huán)境影響，Jebali等研究殺蟲(chóng)劑、久效磷對(duì)鯽魚(yú)、羅非魚(yú)體內(nèi)AChE活性的結(jié)果表明AChE可靈敏反映生物體對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)[30，31]，Seok用硫丹處理泥鰍后，檢測(cè)其各項(xiàng)生理指標(biāo)也表明AChE是良好的指示酶類[32]。本實(shí)驗(yàn)中HHl.MH63組泥鰍的腦AChE活性均略高于空白組，且MH63組腦AChE活性隨稻桿粉濃度的增加而降低，說(shuō)明泥鰍神經(jīng)末梢對(duì)懸浮稻桿粉及水體環(huán)境改變的刺激反應(yīng)敏銳，可引起神經(jīng)興奮促進(jìn)腦部AChE釋放。

肝臟的主要功能是解毒與代謝，當(dāng)遭受不良脅迫時(shí)，即表現(xiàn)出靈敏的應(yīng)激性與防御性。實(shí)驗(yàn)中泥鰍肝臟AchE活性均隨稻桿粉濃度增加而下降，表明稻桿粉對(duì)肝臟AChE活性呈抑制效應(yīng)，與稻桿粉濃度呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。此外，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的AChE活性大小在泥鰍體內(nèi)表現(xiàn)為：腦>肌肉>肝臟，證明了腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，其調(diào)節(jié)和控制機(jī)體適應(yīng)外界變化的靈敏度高于軀體神經(jīng)和內(nèi)臟神經(jīng)，這與Reddy研究鯉魚(yú)不同組織AChE活性的結(jié)果一致[33]。

本研究表明轉(zhuǎn)融合基因CrylAb/Ac水稻HH1對(duì)泥鰍的蛋白水解酶和乙酰膽堿酯酶沒(méi)有明顯影響，而高劑量的轉(zhuǎn)基因水稻或非轉(zhuǎn)基因水稻稻桿粉均會(huì)影響泥鰍的消化能力與神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)飼養(yǎng)100d后的泥鰍進(jìn)行了酶活性檢測(cè)，未能反映酶活性變化動(dòng)態(tài)，研究也是在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的，但轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)水稻大田種植及稻桿還田后是否對(duì)泥鰍有影響，有待進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)的連續(xù)性動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，以期全面了解轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)水生動(dòng)物的影響。

致謝：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授為本項(xiàng)目提供稻種，特此感謝！參考文獻(xiàn)（References）：

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