劉仲娜 鐘金城 柴志欣

摘要：端粒是位于染色體末端的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，對(duì)基因組穩(wěn)定性和完整性起保護(hù)作用。端粒的長(zhǎng)度與細(xì)胞周期密切相關(guān)。其長(zhǎng)度變化機(jī)制分為依賴端粒酶活性和端粒重組兩類(lèi)，氧化應(yīng)激和鉛（Pb）與端粒酶的功能蛋白相結(jié)合抑制其活性，致使端?？s短，硒（Se）與二者具有拮抗作用，延緩衰老。相關(guān)數(shù)據(jù)表明85%腫瘤細(xì)胞與端粒酶活性成正相關(guān)，以端粒酶活性作為腫瘤治療靶標(biāo)稱為當(dāng)代熱點(diǎn)之一。主要對(duì)肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤與端粒的相關(guān)性進(jìn)行了綜述，以期為端粒和端粒酶在癌癥治療研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：端粒；端粒酶；腫瘤

中圖分類(lèi)號(hào)：Q754

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）03-0260-05

20世紀(jì)30年代，人們開(kāi)始了解染色體上的一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽狀”結(jié)構(gòu)，維持染色體的完整和細(xì)胞活性，其實(shí)質(zhì)為一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。端粒與有絲分裂有著密切的聯(lián)系，細(xì)胞每分裂一次，端粒就縮短30～200bp，當(dāng)縮短到2～4kb，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制功能衰退，引起細(xì)胞衰老或死亡，被科學(xué)家稱為“有絲分裂時(shí)鐘”和“生命時(shí)鐘”[1，2]。端粒的延長(zhǎng)和重組機(jī)制都是通過(guò)端粒酶來(lái)催化和介導(dǎo)的，端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞活性和潛在的增殖能力等方面發(fā)揮重要作用。鑒于端粒酶在正常組織體細(xì)胞中的活性被抑制，而在腫瘤中則被重新激活，可能參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制，成為醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。2009年美國(guó)3位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶結(jié)構(gòu)及其對(duì)染色體末端的保護(hù)功能，而獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1端粒和端粒酶

1.1端粒的結(jié)構(gòu)和功能

端粒是位于染色體末端由一個(gè)富含G的DNA串聯(lián)重復(fù)序列[3]和端粒結(jié)合蛋白組成，每個(gè)重復(fù)序列一般為5—7bp[4]。不同物種其重復(fù)序列存在l～2個(gè)堿基差異，哺乳動(dòng)物的端粒重復(fù)序列為5'-（TTAGGG）n-3'[5]，植物的端粒重復(fù)序列為5'一（TTTAGGG）n-3'[6]。端粒長(zhǎng)15～20kb，其重復(fù)序列成T環(huán)結(jié)構(gòu)，像帽子一樣能有效防止染色體間末端重組、融合和染色體退化[7]。末端復(fù)制問(wèn)題是指真核生物線性染色體在復(fù)制過(guò)程中以RNA為起始引物，當(dāng)DNA聚合酶沿著5'到3'復(fù)制完成時(shí)，RNA被剪切，造成5'末端空缺，從而使5'末端序列縮短。端粒的形成填補(bǔ)了這一空缺，解決了“末端復(fù)制問(wèn)題”，維持染色體末端的穩(wěn)定性和完整性。在正常體細(xì)胞中，端?？呻S著細(xì)胞分裂而逐漸縮短，當(dāng)縮短到一定程度，末端重復(fù)序列不能形成T環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使編碼基因結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致染色體末端融合或降解，使細(xì)胞開(kāi)始走向衰老、死亡。

1.2端粒酶的組成和功能

端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白，在染色體末端能不斷合成端粒序列，具有維持端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞增殖的潛能，是一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶。RNA組分中含有與同源端粒DNA重復(fù)序列TTAGGG的互補(bǔ)序列，而蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA合成，將其加到端粒的3'端，以維持端粒結(jié)構(gòu)及功能。

人的端粒酶是由3個(gè)亞基組成[8]：RNA組分（hu-man telomere RNA，hTR）、端粒酶相關(guān)蛋白（telomerase associated protein）和端粒酶催化亞單位（逆轉(zhuǎn)錄酶組分，human telomerase reverse tran-scriptase，hTERT /hTRT/hEST2），其中催化亞單位位于染色體5P/5。33區(qū)，包括16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，外顯子從104～8616不等。與一般基因結(jié)構(gòu)不同的是，在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)沒(méi)有典型的TATAbox或類(lèi)似序列，卻有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)位于ATG上游，包括多個(gè)SPI（特異性β1糖蛋白）結(jié)合位點(diǎn)、c-myc（一個(gè)受特殊信號(hào)調(diào)節(jié)的可誘導(dǎo)癌基因）結(jié)合位點(diǎn)、AP2結(jié)合位點(diǎn)（脂肪連接蛋白2）。實(shí)驗(yàn)研究表明6種端粒相關(guān)蛋白（TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、POT1、PIPl）構(gòu)成端粒蛋白復(fù)合體稱為shelterin[9]， TRF1和TRF2與端粒雙鏈DNA結(jié)合，POT1結(jié)合在端粒單鏈DNA的3'懸突[10～13]，通過(guò)蛋白之間的相互作用，其他3種蛋白也與端粒相結(jié)合[14，15]。shelterin對(duì)端粒酶活性具有調(diào)節(jié)作用。hTR的存在也對(duì)端粒酶功能至關(guān)重要，影響其穩(wěn)定性與突變，改變體內(nèi)端粒長(zhǎng)度，通過(guò)改變端粒完整性或結(jié)合因子的末端結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞分裂到后期死亡。hTRT/hESrr2是hTR依賴的DNA聚合酶，而hTERT是端粒合成的主要限速成分[16]，臨床上多以hTERT作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

2端粒長(zhǎng)度的變化機(jī)制及影響因素

2.1端粒長(zhǎng)度變化機(jī)制

Kakuos等[17]通過(guò)對(duì)恒河猴和其他非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其端粒長(zhǎng)度至少為23kb，而在人胃中發(fā)現(xiàn)小于10kb的端粒存在，說(shuō)明同一祖先的不同物種之間端粒長(zhǎng)度存在差異。也有實(shí)驗(yàn)表明來(lái)自同一物種不同個(gè)體，不同組織雖然不具有物種特異性，卻有一定的相似性。例如A與B是來(lái)自同一個(gè)體的不同組織，A中的端粒長(zhǎng)度大于B；那么在同一物種不同個(gè)體中的A與B比較，出現(xiàn)A中端粒長(zhǎng)度大于B的比率大，但不保證一定出現(xiàn)。日前，已有科學(xué)家通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，雄性動(dòng)物中的端粒長(zhǎng)度普遍比同種雌性動(dòng)物的短[18]，這可以從分子水平上解釋，在身體健康狀態(tài)相似，同等饑餓的條件下，女性存活時(shí)間大于男性，亦解釋女性壽命普遍長(zhǎng)于男性。

端粒酶的活性不能使端粒的長(zhǎng)度無(wú)限延長(zhǎng)，當(dāng)達(dá)到自身穩(wěn)態(tài)時(shí)，它就會(huì)在此值上下浮動(dòng)。目前科學(xué)家提出端粒長(zhǎng)度的變化機(jī)制：一類(lèi)是依賴端粒酶活性，如生殖細(xì)胞、成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞[19]；另一類(lèi)是端粒重組，如淋巴細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞中有少量甚至沒(méi)有端粒，卻具有很長(zhǎng)的壽命[20]。曾思聰?shù)萚21]研究表明在人類(lèi)胚胎早期發(fā)育過(guò)程中，前期端粒長(zhǎng)度的維持以重組為主要方式；發(fā)育后期端粒酶活性維持端粒在干細(xì)胞向各個(gè)胚層發(fā)育時(shí)的長(zhǎng)度。

2.2影響端粒長(zhǎng)度的因素

端粒長(zhǎng)度變化影響了端粒的結(jié)構(gòu)和功能，端粒結(jié)構(gòu)和功能異常會(huì)導(dǎo)致很多疾病的產(chǎn)生。因此了解影響端粒長(zhǎng)度的因素對(duì)預(yù)防和治療各種疾病尤為重要。

氧化應(yīng)激可以引起端粒長(zhǎng)度的變化，在大多數(shù)細(xì)胞中，氧化應(yīng)激可以使端?？s短，長(zhǎng)久的氧化應(yīng)激在肝病及肝癌形成過(guò)程中起重要作用。為了抵抗氧化應(yīng)激微環(huán)境的影響，可適當(dāng)使用抗氧化劑。在正常體細(xì)胞中，抗氧化劑維持端粒酶的活性，防止端?？s短，延緩細(xì)胞衰老；而在癌細(xì)胞中，抗氧化劑卻抑制端粒酶的活性，促進(jìn)端粒縮短，加速癌細(xì)胞的衰亡[22]。此外Masayuki等[23]研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過(guò)程中父親精子中的端粒酶活性高，作用大，母親相對(duì)較弱，同時(shí)發(fā)現(xiàn)子代端粒長(zhǎng)度與父親的年齡有關(guān)。

Shinobu Ukmori等[24]通過(guò)對(duì)粟酒裂殖酵母的研究發(fā)現(xiàn)，消除TRTl+會(huì)使端粒長(zhǎng)度縮短，消除POTl+會(huì)造成端粒長(zhǎng)度迅速的缺失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)POT1（POT1與大多數(shù)端粒末端的單鏈DNA相連）和Rghl發(fā)生雙突變會(huì)產(chǎn)生致死因子，而TOT1和Rghl雙突變不會(huì)產(chǎn)生致死因子。不但闡明了基因間的相互影響，也為諸多腫瘤疾病的治療提供了理論參考依據(jù)。Harutake Yamazaki等[25]對(duì)裂殖酵母研究表明，Ccql蛋白發(fā)生突變（丙氨酸被93位的蘇氨酸所替代）使端粒酶供給不足導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度減小，但如果直接對(duì)Ccql蛋白中93位處的蘇氨酸磷酸化卻可以促進(jìn)端粒的延伸。同時(shí)Zhong Y等[26]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TPP1磷酸化可以延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。研究證實(shí)酵母端粒結(jié)合蛋白R(shí)aplp與端粒長(zhǎng)度成負(fù)相關(guān)。人與其相對(duì)的蛋白是TRF1和TRF2，但二者機(jī)制不同c27]： TRF1的表達(dá)使端粒酶有效結(jié)合端粒數(shù)量下降，而TRF2的表達(dá)則導(dǎo)致端粒酶降解。

有相關(guān)報(bào)道指出，Pb對(duì)DNA有損害作用，中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室也采用釀酒酵母做過(guò)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)[28]，通過(guò)測(cè)定釀酒酵母細(xì)胞活力、釀酒酵母細(xì)胞端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性以及端粒結(jié)合蛋白R(shí)aplp濃度等相關(guān)數(shù)據(jù)，表明Pb與端粒結(jié)合Raplp的羰基和胺基相互作用，使端粒結(jié)合蛋白R(shí)aplp的正常結(jié)構(gòu)被干擾不能被端粒正常識(shí)別，降低其保護(hù)作用。Se和Pb有一定的拮抗作用，可以形成蛋白復(fù)合物或者是鉛的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而破壞了細(xì)胞對(duì)鉛的吸收和積累；Se對(duì)Pb產(chǎn)生的自由基有一定的清除作用，所以廣大女性應(yīng)減少彩妝的使用，減少Pb毒害，適量補(bǔ)充Se元素，延緩衰老。

3端粒酶在醫(yī)學(xué)上的研究

3.1端粒酶與腫瘤的相關(guān)性

正常體細(xì)胞沒(méi)有端粒酶活性，但永生化細(xì)胞系和超過(guò)85%的腫瘤細(xì)胞顯示端粒酶活性，以防止端粒逐漸縮短。已發(fā)現(xiàn)端粒酶的激活存在于人類(lèi)各種腫瘤和腫瘤衍生的細(xì)胞系中，KheirollahiM等[29]對(duì)50例患者進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)，其中包括26例腦膜瘤和星形細(xì)胞瘤患者，結(jié)果顯示，腦組織中端粒酶活性呈陽(yáng)性的有39例（39/50=65%）；同時(shí)單樣本t檢驗(yàn)表明，端粒酶活性在完全腦膜瘤、星形細(xì)胞瘤中的影響是顯著的（PⅡ期>Ⅲ期[31]。在某種情況下再生障礙性貧血與端粒RNA突變有關(guān)，也會(huì)導(dǎo)致先天性角化不良、骨髓增生異常肺纖維化。

3.2腫瘤的診斷與治療

85%的腫瘤細(xì)胞存在端粒酶活性[32]以端粒酶活性作為腫瘤診斷的靶標(biāo)可增加腫瘤預(yù)知性。酶活性過(guò)度維持是誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵因素之一，國(guó)內(nèi)外的一些研究人員設(shè)想通過(guò)對(duì)端粒和端粒酶的研究可能揭示癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并設(shè)計(jì)基因診斷和基因治療等方案。用ELISA定量、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)婦科惡性腫瘤組織中的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)婦科惡性腫瘤組織中端粒酶的活性明顯高于良性病變和正常組織。類(lèi)似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)在普通腦膜瘤、急性髓性白血病、膀胱癌腫瘤、乳腺癌等惡性腫瘤患者中。目前，以腫瘤中被激活的端粒酶為靶點(diǎn)，研制出治療室管膜細(xì)胞瘤的新藥物，并已在分離得到的室管膜細(xì)胞瘤細(xì)胞中證實(shí)了其功效。但并不是所有腫瘤都和端粒酶活性存在相關(guān)性，Zhang Y等[33]研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤（OS）細(xì)胞株利用端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制維持其長(zhǎng)度，在此病治療時(shí)利用抗端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制可能比抗端粒酶活性更有效果。由于腫瘤組織多通過(guò)患者的診斷、治療才能獲得，直接取樣對(duì)患者來(lái)說(shuō)創(chuàng)傷性大，且治療可能會(huì)影響組織的端粒長(zhǎng)度，因此檢測(cè)腫瘤組織端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值有限。如果采用腫瘤替代組織，如收集唾液、采取口腔細(xì)胞以及外周血，減少了其他人為因素對(duì)端粒長(zhǎng)度的影響。然后通過(guò)定量PCR、熒光原位雜交（FISH）等技術(shù)準(zhǔn)確測(cè)量端粒的長(zhǎng)度，以此來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)性。

3.3最新研究發(fā)現(xiàn)

隨著分子生物學(xué)發(fā)展步伐的加快，人們發(fā)現(xiàn)癌癥致死的因素與端粒缺失密切相關(guān)，研究表明端粒的缺失可能存在4個(gè)因素：第一，在癌細(xì)胞中由于復(fù)制壓力導(dǎo)致脆性位點(diǎn)的雙鏈斷裂頻率上升；第二，端粒本身屬于脆性位點(diǎn)；第三，端粒近端區(qū)易發(fā)生雙鏈斷裂；第四，癌細(xì)胞中染色體不能完成自我修復(fù)。端粒縮短使細(xì)胞衰老或死亡。

近幾年在端粒研究方面取得了新的進(jìn)展。2007年A-T科學(xué)公司研制出以端粒為靶標(biāo)的TA-65營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充片，其可以提高人的骨密度和免疫力，具有延緩衰老的作用.但如果過(guò)量服用卻增加了致癌風(fēng)險(xiǎn)。2012年美國(guó)杜克大學(xué)基因組學(xué)與政策研究所對(duì)家庭暴力可能對(duì)兒童的DNA造成破壞并導(dǎo)致早衰進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，家庭暴力會(huì)使兒童染色體端?？s短速度加快，與同齡人相比患心臟病的時(shí)間提前7～10年。同年芬蘭研究人員發(fā)現(xiàn)，超負(fù)荷和高壓力工作會(huì)使人體細(xì)胞中染色體端?？s短，加快衰老。今年2月美國(guó)卡內(nèi)基一梅隆大學(xué)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的感冒與一種特定類(lèi)型的白細(xì)胞CD8CD28_T細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度相關(guān)，研究指出該細(xì)胞端粒越短越容易患感冒。利用熒光定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同人群進(jìn)行端粒長(zhǎng)度的測(cè)量，判斷是否是易感人群，可提前采取感冒預(yù)防措施。

4研究前景與展望

端?？s短會(huì)造成DNA損傷、炎癥和氧化應(yīng)激等反應(yīng)。無(wú)論是引起心血管疾病的危險(xiǎn)因素或是常見(jiàn)的心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟衰竭、高血壓，都呈現(xiàn)白細(xì)胞端?？s短。盡管端粒長(zhǎng)度并不滿足作為人體衰老的唯一標(biāo)志，但如果結(jié)合實(shí)際年齡卻可以作為心腦血管老化的標(biāo)志，這對(duì)日后診斷心血管疾病提供參考依據(jù)。端粒酶與衰老的聯(lián)系也逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，衰老的發(fā)生是由衰老細(xì)胞的逐漸累積而引起，具體表現(xiàn)為細(xì)胞停止生長(zhǎng)、端粒酶活性降低和端粒功能異常，其中端粒功能異常主要包括端?？s短、端粒DNA損傷、端粒結(jié)構(gòu)異常。端粒酶活性激活，防止端粒在復(fù)制中不斷縮短，使細(xì)胞壽命得以延長(zhǎng)。但過(guò)度維持端粒酶活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞永生化，發(fā)生腫瘤病變。在以端粒酶的酶活性為靶標(biāo)研發(fā)新藥時(shí)，應(yīng)注意藥物劑量。

端粒和端粒酶結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)現(xiàn)是分子生物學(xué)發(fā)展的又一里程碑，不僅揭示了對(duì)染色體的保護(hù)作用，而且合理準(zhǔn)確地解釋了“末端復(fù)制問(wèn)題”。其作為影響人類(lèi)衰老和癌變的因素之一，給未來(lái)抗衰老及腫瘤治療等醫(yī)學(xué)難題指明了方向，提高治愈機(jī)率。但對(duì)其研究仍存在盲區(qū)，利用基因克隆及測(cè)序技術(shù)查找相關(guān)功能基因、結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)和功能、分析功能基因與端粒的相關(guān)性等方面仍有很多尚待發(fā)現(xiàn)的新突破。此外，shelterin復(fù)合體形成帽狀結(jié)構(gòu)對(duì)染色體的保護(hù)功能并十分不明確，可分別對(duì)6種蛋白進(jìn)行敲除來(lái)研究其代謝途徑，找出與其相關(guān)疾病的致病基因，利用藥物基因組學(xué)研發(fā)特異性高、毒副作用低、藥效好的藥物，以期為醫(yī)學(xué)研究作出重大的貢獻(xiàn)，同時(shí)也為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

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