鄭志 牛華 張桂前 范欣 高玉紅 孫鹥

摘要：Syncytin是人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)家族的囊膜蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)Syncytin與白血病密切相關(guān)。為研究Syncytin的生物學(xué)功能，我們克隆了人syncytin，并連接到pIRES2-EGFP質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒至感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR、酶切電泳和DNA測序鑒定，成功構(gòu)建了表達(dá)syncytin基因的真核表達(dá)載體。利用羅氏轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至EL4細(xì)胞，并通過G418選擇性培養(yǎng)基篩選，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中Syncytin表達(dá)，用RT-PCR、Western blot檢測Syncytin表達(dá)水平，結(jié)果顯示我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人Syncytin的ELA細(xì)胞系。穩(wěn)定表達(dá)人Syncytin的EL4細(xì)胞系的建立，為進(jìn)一步研究人Syncytin功能及其與白血病免疫逃逸的關(guān)系提供了重要的細(xì)胞模型和實(shí)驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Syncytin蛋白；pIRES2-EGFP質(zhì)粒；真核表達(dá)載體；EL4細(xì)胞；白血病

中圖分類號：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）03-0205-06

人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（human endogenousretrovlruses，HERV）是幾百萬年前整合到人類基因組中，并以孟德爾方式遺傳至今的逆轉(zhuǎn)錄病毒的殘余物，約占人類基因組DNA的8%[1]。大多數(shù)HERVs在進(jìn)化過程中由于突變、缺失等的積累失去了編碼能力[2，3]，但仍有少數(shù)HERVs的開放閱讀框（open reading frames，ORFs）被完整保留了下來。這些完整的ORFs可以編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白，在一些特定的組織或分化發(fā)育的特定階段表達(dá)，可能具有重要的生理意義。Syncytin是HERVs-W家族的囊膜蛋白，主要在胎盤中表達(dá)，介導(dǎo)合胞滋養(yǎng)層的形成，維持胎盤正常的生理功能[4]。HERVs已被證實(shí)與腫瘤形成密切相關(guān)，如乳腺癌[5]、慢性骨髓瘤白血病[6，7]，研究發(fā)現(xiàn)syncytinmRNA和Syncytin在9種白血病或淋巴瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)[8]，具有潛在的研究價值。

Syncytin的373-397殘基是一個具有免疫抑制活性的多肽[9]，其在細(xì)胞表面的大量表達(dá)有利于癌變細(xì)胞逃避免疫打擊，同時其具有的融合活性有利于細(xì)胞的遷移[10]。本研究擬構(gòu)建syncytin，真核表達(dá)載體，并通過羅氏轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染小鼠淋巴瘤細(xì)胞細(xì)胞株（EL4），并通過G418抗性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定表達(dá)Syncytin的細(xì)胞系，通過RT-PCR和Western blot分別從mRNA與蛋白水平驗證syncytin在EL4細(xì)胞中的表達(dá)情況。穩(wěn)定表達(dá)syncytin基因的EL4細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步探討syncytin基因異常表達(dá)對白血病免疫逃逸的機(jī)制提供細(xì)胞模型和實(shí)驗基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

PIRES2-EGFP質(zhì)粒、C8166細(xì)胞由本實(shí)驗室保存，E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Marker 2500購自天根生物技術(shù)公司；EL4細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶（EcoR I、BamH I）、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、SYBR MASTER Mixture、Trizol試劑均購于日本Takara公司；X-tremeGENE HPDNA Transfection Reagent購自羅氏公司；PCR引物及RT-PCR引物由華大基因合成；RPMI1640液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol、Opti-MEM均購于美國Invitrogen公司；Syncytin（H-280）抗體購自美國SANTA公司；Real time PCR儀（日本TAKARA公司）；凝膠成像儀（天能公司）攝像分析，Nanodrop分光光度儀（美國Thermo公司），熒光顯微鏡（H本Olympus公司），CO2培養(yǎng)箱（日本三洋），其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2pIRES2-syncytin-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank中的人syncytin基因編碼區(qū)序列（核苷酸庫中的編號：AF072506.2）設(shè)計了兩套引物，外圍引物（s-1，s-2）和內(nèi)圍引物（S，A），內(nèi)圍引物中在上游引物5'端引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物5'端引入BamH I酶切位點(diǎn)。S-l：5'-AGGACCCTACCCAGTCATTTTATCT-3'、S-2：5'-GAAGACTTGGGTTTATATCCCGATC-3，：S：5'-CG-GAATTCATGGCCCTCCCTTATCAT-3'、A：5'-CGGGATCCCTAACTGCTTCCTGCTG-3'。培養(yǎng)C8166細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，以其為模板利用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min 30s，共40個循環(huán)；以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用高保真DNA聚合酶PirmeSTARMAX進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的目的片段syncytin，擴(kuò)增片段大小為1.6kb。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 10s、62℃ 5s、72℃ 10s，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，用EcoR I/BamH I雙切后純化回收，隨后用T4 DNA連接酶將其與EcoR I /Bam，H I雙切后電泳凝膠回收的PIRES2-EGFP線性質(zhì)粒進(jìn)行16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，接種至含卡那霉素（Kan+）的LB瓊脂糖培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基（含Kan+）中，37℃振搖過夜。用質(zhì)粒小量提取試劑盒重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR及EcoR I/BamH I限制性內(nèi)切酶雙切后電泳鑒定，陽性質(zhì)粒送樣測序后經(jīng)DNA序列分析驗證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pIRES2-syncytin-EGFP。

1.3穩(wěn)定表達(dá)Syncytin的EL4細(xì)胞系的建立

1.3.1EL4細(xì)胞的培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

ELA細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。參照羅氏轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別完成重組載體pIRES2 -syn-cytin-EGFP和空載體pIRES2-EGFP的轉(zhuǎn)染。1）轉(zhuǎn)染前4h，將處于對數(shù)生長期的EIA細(xì)胞以lx105密度鋪于24孔板，使細(xì)胞匯合度至80%～90%；2）轉(zhuǎn)染前用無血清無雙抗1640洗滌細(xì)胞；3）50μL OPTI-MEM分別稀釋0.5μg DNA，室溫孵育5min；4）50μL OPTI-MEM分別稀釋1.5μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，室溫孵育5min；5）將3）、4）中的液體混合，室溫孵育15～20min；6）將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞孔板中，輕柔震蕩混勻，放人37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；7）轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.3.2穩(wěn)定表達(dá)Syncytin的EL4細(xì)胞系的獲得

將對數(shù)生長期的EL4細(xì)胞接種于24孔板，每孔5000個，分別加入0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、l 10022、1200mg/L的G418，3d換一次含有相同濃度的培養(yǎng)液，篩選14d，以細(xì)胞全部死亡的最低G418質(zhì)量濃度為最佳篩選劑量。重組質(zhì)粒pIRES2-syncytin-FGFP轉(zhuǎn)入EI4細(xì)胞48h后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，并更換含有G418的l640培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每隔3d更換培養(yǎng)液1次。2周后對篩選的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法挑選細(xì)胞，鋪96孔板，挑出單個細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得具有G418抗性的穩(wěn)定表達(dá)syncytin的EL4細(xì)胞系，命名為ELA-Syncytin細(xì)胞和空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.4RT-PCR檢測syncytin轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

收集EL4-Syncytin細(xì)胞和空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，按Trizol試劑說明書抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用Prime5.0軟件設(shè)計syncytin，上下游引物，上游引物5'-ATCCCCCGCAACTGCTATC-3'，下游引物5'-AGACAGTGACTCCAAGTCCTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為112bp。內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-GGTGAAGCJTCGGTGTGAACG-3'，下游引物5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為233bp。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s；55℃退火15s；72℃延伸20s，共30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min。對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5Western印記檢測細(xì)胞中Syncytin蛋白的表達(dá)

收集EL4-Syncytin細(xì)胞和空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的單去污裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置5min，超聲充分碎裂，4℃，12000r/min離心10min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。用BCA進(jìn)行蛋白定量，再加入5xloadingbuffer混勻后煮沸5min，離心后-80℃凍存?zhèn)溆?。各?0μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)使蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2h，與兔抗人Syncytin抗體（美國Santa公司）孵育過夜，用TBST洗PVDF膜3次，每次5min；再與HRP標(biāo)記的山羊抗兔的抗體室溫孵育2h，TBST洗PVDF膜3次，每次5min，化學(xué)發(fā)光劑顯影并保存圖像。

2結(jié)果與分析

2.1syncytin基因ORF的擴(kuò)增

以C8166細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所得PCR產(chǎn)物片段約為1621bp，與預(yù)期的syncytin基因ORF長度一致（圖1）。表明syncytin，基因ORF被成功克隆。

2.2重組質(zhì)粒的鑒定

pIRES2-syncytin-EGFP重組質(zhì)粒與空載體分別EcoR I /BamH I雙切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可約見1.6kb與5.3kb大小片段，與預(yù)計大小相符（圖2）。DNA測序結(jié)果顯示與人的syncytin ORF序列一致。可表達(dá)syncytin基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3穩(wěn)定表達(dá)Syncytin的EL4細(xì)胞系的鑒定

2.3.1pIRES2-syncytin-EGFP非融合綠色熒光蛋白的表達(dá)

在EL4-Syncytin細(xì)胞中，可清楚地觀察到熒光蛋白（圖3A、B、C、D），表明所構(gòu)建的重組synctin載體已在EL4細(xì)胞表達(dá)。

2.3.2RT-PCR檢測syncytin，基因的表達(dá)

提取EL4-Syncytin細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，以小鼠GAPDH基因為內(nèi)參，運(yùn)用qRT-PCR對syncytin進(jìn)行相對定量。每個實(shí)驗組兩個復(fù)孔，實(shí)驗重復(fù)3次。通過各組樣品Ct值，利用2-△△Ct法計算得出EL4-Syncytin組為空載體對照組的120倍，表明syncytin在EL4細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)。實(shí)驗結(jié)果見圖4（A、B、C、D）。

2.3.3Western印記檢測人Syncytin表達(dá)

EL4-Syncytin細(xì)胞和空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞所提總蛋白經(jīng)Western印記檢測，內(nèi)參顯影條帶亮度一致，EL4-Syncytin組條帶亮度明顯高于對照組，通過灰度值計算軟件處理計算出實(shí)驗組與對照組數(shù)據(jù)（見圖5、6），EL4-Syncytin組蛋白表達(dá)水平明顯高于空載體組蛋白表達(dá)水平，表明Syncytin在EL4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)且高表達(dá)。

3討論

腫瘤對人類的生命和健康造成了極大的威脅。以白血病為例，白血病是國內(nèi)10個高發(fā)的惡性腫瘤之一，是35歲以下人群發(fā)病率的死亡率最高的惡性腫瘤。白血病的病因與發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前還未完全清楚，病毒因素、遺傳因素、染色體及免疫功能遺傳都與白血病發(fā)病有關(guān)。由于對大多數(shù)白血病發(fā)病的病因、病理機(jī)制缺乏系統(tǒng)深入研究，致使臨床上多數(shù)患者得不到早期診斷和規(guī)范治療，療效和預(yù)后較差。盡管目前已發(fā)現(xiàn)多個基因與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但是能真正用于白血病診斷及治療的基因為數(shù)不多。尋找與白血病相關(guān)的基因，研究它們在白血病發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，對白血病的早期診斷和治療具有重要意義。

人類內(nèi)源性病毒（HERV）是遠(yuǎn)古逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人類基因組后留下的遺跡。其組成約占人類基因組3%～8%。目前，可分為至少31個家族[1，2]。由于基因突變的原因，大多數(shù)人類內(nèi)源性病毒基因已失去轉(zhuǎn)錄活性[3]。只要少數(shù)的基因保留了完整的開放讀碼框。多項研究表明，人類內(nèi)源性病毒基因的異常表達(dá)與腫瘤形成密切相關(guān)。Syncytin是HERVs-W家族的囊膜蛋白，主要在胎盤中表達(dá)，介導(dǎo)合胞滋養(yǎng)層的形成，維持胎盤正常的生理功能[4]。本研究小組在最近的研究中，偶然發(fā)現(xiàn)syn-cytin， mRNA和Syncytin蛋白在9個白血病或淋巴瘤細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)，而且syncytin基因的表達(dá)水平與白血病患者病情相關(guān)。通過對Syncytin的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Syncytin內(nèi)存在一個具有免疫抑制活性的肽段，其373～397殘基是一個具有免疫抑制活性的多肽，其在細(xì)胞表面的大量表達(dá)利于癌變細(xì)胞逃避免疫打擊，同時其具有的融合活性有利于細(xì)胞的遷移。目前未見到syncytin（mRNA及蛋白）與血液系統(tǒng)腫瘤的文獻(xiàn)報道，此基因與白血病的相關(guān)性為我們首次發(fā)現(xiàn)并已獲得專利。syncytin是怎樣參與白血病腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制并發(fā)揮作用目前仍待進(jìn)一步研究。

本研究以C8166細(xì)胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得syncytin的cDNA全長，并成功將其克隆到pIRES2-EGFP載體CMV啟動子下游，從而成功構(gòu)建了可在真核細(xì)胞中表達(dá)Syn-cytin蛋白的pIRES2-syncytin-EGFP表達(dá)載體。將該載體轉(zhuǎn)染至EL4細(xì)胞，并通過篩選建立了人syncytin基因穩(wěn)定表達(dá)的EL4細(xì)胞系。以空載體質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞為對照，用RT-PCR和Western印記分別從mRNA和蛋白水平檢測了Syncytin的表達(dá)。結(jié)果顯示，syncytin基因能有效地在EL4細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯，表明成功建立了穩(wěn)定表達(dá)人Syncytin的EL4細(xì)胞系。該真核表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立，為syncytin在白血病腫瘤中的作用和其免疫逃逸機(jī)制的研究提供了必要的細(xì)胞模型，為后續(xù)功能實(shí)驗奠定了基礎(chǔ)。

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